Obiectivele cursului

Obiectivele acestui curs, care se vor reflecta și în modul de notare, sunt dobândirea de informații despre caracteristicile esențiale ale celulelor tumorale, așa cum sunt descrise acum, caracteristici care se concentrează asupra biologiei celulare tomorale, precum și asupra terapiilor țintă în care sunt implicate molecule modificate. 

Pentru cei care lucrează în clinici, scopul cursului este de a-i face capabili să înțeleagă markerii tumorali și relația dintre identificarea acelor gene sau proteine modificate în cancer pe care un biolog le determină prin metode analitice. Pentru cei care nu se întâlnesc cu clinica sau cu cercetarea, cursul are și un rol de popularizare a științei în domeniu, de demistificare a unor idei eronate care circulă din ce în ce mai mult în lumea informațională. Din punct de vedere al cunoștințelor care vor fi asimilate celor care absolvă acest curs vor putea, în primul rând, să enumere și să descrie cele zece semne distinctive celulare ale cancerului, se poate înțelege modul în care aceste proprietăți celulare fac diferența dintre o celulă tumorală și o celulă eucariotă umană normală. În cele din urmă, se poate descrie în detaliu modul în care aceste semne distinctive fac o celulă tumorală mai potrivită sau mai competitivă, supraviețuind și reproducându-se în gazda sa, care este corpul uman.

Cursul este structurat în două părți. În primele 5 cursuri vom analiza conceptele biologice din spatele terapiilor țintite, iar începând cu cursul 6 vom discuta despre semnificația terapiilor țintite, aplicațiile lor clinice și multe exemple de terapii moleculare moderne în cancerele cu cea mai mare incidență.

Principalele obiective ale primei părți a cursului sunt:

1. Să înțelegem ce este cancerul și cum este inițiat.
2. Să înțelegemcaracteristicile distinctive ale celulelor tumorale.

Pentru a îndeplini aceste obiective trebuie să știm câteva momente importante din istoria dezvoltării de tratamente pentru cancer, să avem noțiuni elementare de biologie celulară și genetică.

O parte din ilustrațiile acestui curs sunt utilizate cu acordul creatorilor:

Jeanne Kelly. Copyright 2013.

Dr. Elaine Vickers fondator Science Communicated LTD.

Scurt istoric al înțelegerii biologiei tumorale și terapiilor cancerului

O descriere sugestivă a cancerului a venit de la Dr. Francisc Peyton Rous în Prelegerea Nobel din decembrie 1966. El a declarat că " Tumorile distrug omul într-un mod unic și îngrozitor, trup din trupul sau devenind cumva proliferativ, agresiv, distrugator și neguvernabil. Ele sunt cele mai concrete și formidabile maladii umane, dar în ciuda a mai mult de 70 de ani de studiu experimental rămân cel mai puțin înțelese. Aproximativ 50 de ani mai târziu, James Allison, laureat al premiului Nobel pentru descoperirea imunoterapiilor, a spus că "Deoarece terapia punctului de control imun (anticorpi anti-CTLA-4 și anti-PD-1 / PD-L1) vizează celulele imune și, în special, celulele T, aceste tratamente pot oferi teoretic beneficii clinice tuturor pacienților cu cancer, indiferent de tipul tumorii. Datele clinice susțin această noțiune, deoarece mai multe studii clinice au raportat beneficii pentru multe tipuri diferite de cancer, ceea ce a determinat FDA din SUA să aprobe terapii cu puncte de control imun pentru pacienții cu diagnostice de: melanom, carcinom cu celule renale, cancer de vezică urinară, cancer gastric, cancer de cap și gât, cancer pulmonar cu celule non-mici, boala Hodgkin și chiar tumori definite de mutații genetice cunoscute sub numele de instabilitate micro-satelit (MSI), spre deosebire de tumorile definite de localizarea anatomică. Este clar din aceste descrieri venite din partea a două personalități Nobel că s-a făcut un progres substanțial în acest scurt interval istoric în care cursa pentru un tratament specific cancerului sau "glonțul magic" a adunat o comunitate mare de oameni de știință, organizații civile și pacienți.

Este adevărat că cancerul a fost descris încă de la Hypocrates (460-370 î.Hr.), care, pe baza "teoriei sale umorale", a considerat cancerul ca orice dezechilibru între flegmă, bilă galbenă și bilă neagră. "Părintele medicinei" a folosit termenii carcinos și carcinom pentru a descrie tumorile care nu formează ulcer și care formează ulcer. Mai târziu,în 1700, Georg Ernst Stah și Friedrich Hoffmann, profesor la Universitatea din Halle, Germania, au denunțat că "tumorile cresc din limfa care le transportă permanent, cunoscută sub numele de "teoria limfatică". În jurul acestei perioade din istoria cancerului și, de fapt, din istoria științei, chirurgia a devenit terapia aplicată pentru îndepărtarea tumorilor. Bazele înțelegerii noastre moderne a cancerului provin de la o personalitate uriașă care a dezvoltat o nouă ramură științifică numită "patologie celulară" și care a exprimat într-o singură declarație baza creșterii și dezvoltării organismelor, consecutiv principala trăsătura a cancerului. Omnia cellulae e cellula ("Orice celulă provine dintr-o altă celulă") este teoria celulară pe care Rudolf Vircow a oferit-o comunității științifice și care indică, de fapt, procesul de diviziune celulară.

Începând cu secolul 20 s-au făcut pași uriași în știință și tehnologie și descoperirea procesului de iradație, a permis noi terapii împreună cu dezvoltarea de noi substanțe chimice care au fost utilizate în chimioterapii. De asemenea, guvernele au susținut cercetarea în domeniul cancerului și comunitatea a început o cursă pentru "glonțul magic" care a culminat cu remisiile temporare de leucemie acută la copii produse de antagonistul acidului folic, acidul 4-aminopteroil-glutamic (aminopterină). Îi datorăm această descoperire lui Sidney Farber în 1947. O altă piatră de hotar importantă în această cursă a fost descoperirea lui Peyton Rous a oncovirusurilor, virusuri care produc cancer în galinacee. De aici înainte, definirea ongenelor și a genelor supresoare tumorale a deschis o nouă eră, era medicinei precise, a terapiilor țintite în cancer. Tasuku Honjo și James Allison sunt oamenii de știință care au implementat mmunoterapiile, care este una dintre marile speranțe ale pacienților din zilele noastre. Pe scurt, terapiile pentru cancer au urmat acest curs de timp în istorie:

Fără tratament: până în 1940

Chirurgie: 1955

Radioterapie: 1955~1965

Chimioterapia: după 1965

Imunoterapie si terapie genica 2010-prezent

Chirurgia modernă a cancerului urmărește: detectarea exactă a dimensiunii și localizării tumorii; minim invaziv, pentru îndepărtarea strictă a țesutului tumoral și utilizarea împreună cu alte tratamente (chimioterapie, radioterapie) pentru a minimiza posibilitatea recurenței. Reapariția cancerului după tratamentul inițial se numește "cancer recurent". Poate apărea în același loc (recidivă locală), în apropiere (recurență regională) sau într-un alt loc (recurență la distanță). Motivele depistate până acum pentru recidiva tumorii după operație pot fi: celule tumorale lăsate la locul lor după intervenție, celule detașate de tumora primară chiar înainte de operație, dar care nu pot fi detectate. Recurența după radioterapie sau chimioterapie se datorează eterogenității tumorii. Deși terapiile atacă celulele tumorale, nu toate sunt în același stadiu de diviziune, unele pot fi în stare latentă.

În ciuda pașilor uriași pe care i-am făcut în această călătorie, trebuie să răspundem la următoarele întrebări: care este momentul în care a fost inițiat cancerul? Câți ani are cancerul? Unde suntem în această maladie? Putem câștiga bătălia împotriva ei?

Ce sunt terapiile țintite moleculare?

Reprezintă un tratament mult mai selectiv fațăa de chimioterapie. Cu toate acestea nici o metoda actuala nu este 100% specifică. Mai mult, și aceste terapii au efecte secundare, deși mult mai reduse.În tabel sunt descrise terapiile țintite pe care le vom discuta la curs, dar și terapiile excluse din aceste prezentări.

Urmăriți pagina unde este descrisă importanța terapii țintite în cancer. Ce Înseamnă terapia țintită pentru noi?

Definiția și caracteristicile țesuturilor în cancer

Înainte de a intra în detaliile cancerului, să definim mai întâi această boală. De fapt, cancerul reprezintă un grup de maladii, iar acest lucru se datorează faptului că descriem "200 de tipuri" de cancere, în funcție de caracteristicile moleculare ale bolii. Pentru a înțelege conceptul, cea mai simplă definiție a cancerului este ca grup de boli caracterizate prin diviziune celulară necontrolată. Cancerul este numit, de asemenea, neoplasm sau tumoare malignă. De aici trebuie să stăpânim detaliile diviziunii celulare și să înțelegem ce gene și proteine participă la aceasta. Și astfel, vom recunoaște schimbările moleculare care fac această maladie atât de eterogenă și dificil de tratat. Pe scurt, afirmăm că Cancerul începe atunci când o mutație genetică provoacă o proliferare exagerată a celulelor care vor forma o tumoare. Cele mai multe tipuri de cancer încep din cauza modificărilor genetice care apar pe tot parcursul vieții unei persoane și doar câteva apar din cauza genelor defecte moștenite, transmise în familii. Deci, mesajul principal al terapiilor moderne este că cancerul este o boală genetică, dar nu ereditară obligatorie. Prin urmare, terapiile moderne intenționează să vizeze gena sau proteina exactă care este defectă într-un anumit tip de cancer.

Figura 1. Etapele dezvoltării cancerului și relația cu terapiile țintite

Un neoplasm pornește de la o celulă care, din cauza unei erori genetice, începe să se dezvolte necontrolat, provocând procesul de hiperplazie (= creșterea numărului de celule). Hiperplazia poate fi consecutivă unei presiuni pe o suprafață (de exemplu, un porumb) sau în diverse alte situații, dar în acest caz celulele sunt identice din punct de vedere morfologic, iar creșterea lor necontrolată poate fi ajustată din nou.

În schimb, în cazul celulelor canceroase, proliferarea celulară nu mai poate fi controlată prin mecanisme celulare intrinseci, apar celule cu morfologie anormală, variază ca formă și mărime și țesutul apare în formă dezorganizată. Această etapă este considerată pre-malignă și se numește displazie, iar celulele care sunt observate modificate histologic se numesc celule displazice.

Carcinomul in situ înseamnă carcinom la locul apariției. În acest carcinom in situ, pot apărea mutații suplimentare care vor transforma tumora într-una invazivă. O tumoare invazivă se caracterizează prin dezvoltarea de noi vase de sânge, proces numit angiogeneză, și prin secreția de produse care vor stimula dezvoltarea continuă a acesteia, numite factori de creștere: cum ar fi factorul de creștere endotelial vascular (VEGF) sau factorul de creștere epidermică (EGF).

Apoi urmează procesul de intravazare, care reprezintă intrarea celulelor tumorale în pereții vaselor de sânge. Celule endoteliale observate și microscopice (ar putea fi condiționate să prolifereze dacă ar fi cultivate pe geluri 3D speciale care conțin o matrice de colagen. Apoi, vasele de sânge dezvoltate sunt vizualizate sub microscopul confocal, după ce au fost marcate cu markeri endoteliali și alfa laminină, o proteină situată la nivelul lumenului, rețeaua vasculară poate fi vizualizată. Prin tratarea acestei rețele cu celule canceroase se observă modul în care se observă penetrarea celulelor tumorale în interiorul vaselor de sânge . Din această tumoare câteva celule vor intra în circulație și vor forma celule noi în alte organe. Acest proces se numește metastază.

Metastază

Metastazele sunt procesul de migrare a celulelor dintr-un organ sau țesut în alt organ, la nivelul căruia acestea vor prolifera în continuare. Celulele vor difuza la alte organe prin sânge și limfă. Ele se pot multiplica în continuare la locul de diseminare, comprimând țesuturile și afectând astfel organele vecine. Melanomul (cancerul de piele) care apare în celulele pigmentare și se dispersează în organele distale, cum ar fi creierul sau ficatul, tumora formată în ficat se va numi "melanom metastatic".

Tipuri de incidență și mortalitate a cancerului

Aproximativ 1 din 3 persoane va dezvolta cancer la un moment dat în viața lor. În 2012, aproximativ 14,1 milioane de tipuri de cancer au fost diagnosticate la nivel mondial - 7,4 milioane la bărbați și 6,7 milioane la femei. Cea mai comună localizare a lor, reprezentând peste 1,8 milioane, a fost în plămâni. Au urmat cancerul de sân, colorectal, prostată și stomac. Cu toate acestea, știați că 300.000 de tipuri de cancer care au fost diagnosticate au fost cancere de buze / cancer oral și 178.000 au fost în vezica biliară?

Deși cancerul poate afecta pe oricine, la orice vârstă, în realitate este în principal o boală a bătrâneții. De exemplu, știați că peste 1/3 din cazurile de cancer sunt diagnosticate la persoanele cu vârsta peste 75 de ani? Sau că până la vârsta de paisprezece ani, 1 din 500 de copii va avea cancer (de departe cel mai frecvent dintre ei fiind leucemia)? Dacă sunteți un bărbat cu vârsta cuprinsă între 15 și 24 de ani, cel mai frecvent cancer pe care îl veți dezvolta probabil este cancerul testicular. Dacă sunteți o femeie cu vârsta cuprinsă între 24 și 49 de ani, este de două ori mai probabil decât pentru un bărbat de aceeași vârstă să dezvolte cancer. Această mare diferență între bărbați și femei se datorează în mare parte incidenței cancerului de sân la femeile de această vârstă.

Ratele de supraviețuire variază, de asemenea, enorm. Ratele de supraviețuire a leucemiei la copii au crescut foarte mult datorită tratamentelor îmbunătățite. Rata de supraviețuire pentru anumite tipuri de leucemie este cu mult peste 80%, comparativ cu aproximativ 30% la începutul anilor 1970. Este posibil să fiți conștienți de recenta campanie controversată din Marea Britanie condusă de organizația caritabilă "Pancreatic Cancer Action", care a subliniat că, în timp ce peste 85% dintre pacienții diagnosticați cu cancer de sân și 95% dintre bărbații diagnosticați cu cancer testicular vor fi încă în viață 5 ani mai târziu, doar 3% dintre cei diagnosticați cu cancer pancreatic vor supraviețui acestei perioade de timp. În timp ce aceste cifre se află la capetele extreme ale spectrului, unele tipuri de cancer poartă cu ele un prognostic mult mai rău decât altele - cancerele pulmonare și de stomac fiind printre cele de la capătul inferior al scalei. După cum vom vedea mai târziu în curs, totuși, tratamentele personalizate sau "de precizie" sunt, de asemenea, o promisiune uriașă pentru unele dintre aceste condiții de prognostic mai slabe.

În general, tumorile maligne pot fi clasificate în tumori solide (care apar în țesuturile epiteliale, conjuctive și osoase din organism) și care, de obicei, nu conțin chisturi sau suprafețe cu tumori fluide și lichide care sunt leucemii și limfoame. Cancerul poate lua multe forme și poate afecta pacienții în moduri diferite. Acest lucru poate fi dificil de înțeles pentru pacienți și familie.

Ocazional, cancerul poate fi detectat "întâmplător" printr-un test de laborator sau cu raze X – efectuat într-un screening de rutină sau dintr-un motiv complet diferit. Într-un astfel de caz, cancerul devine observat aproape accidental. În acest moment, se poate face referire la "masă", o "creștere", o "tumoare", un "nodul", un "loc", un "nod", o "leziune" sau o "malignitate".

În general, tumora trebuie să atingă o dimensiune de un centimetru sau să fie formată din aproximativ un milion de celule, înainte de a fi detectată. Excepțiile de la această regulă generală includ cazurile de cancer al sângelui și măduvei osoase - numite limfoame și leucemii - care frecvent nu produc o "masă", dar vor fi evidente la testele de laborator; Aceste tipuri de cancer au încă nevoie de mai mult de un milion de celule pentru a fi prezente înainte de a fi detectate. Limfoamele și leucemiile sunt exemple de "tumori lichide" - sau cancere prezente în fluidele corporale (sânge și măduvă osoasă) și sunt detectabile prin teste de laborator. Tumorile "solide", inclusiv cancerele pulmonare, de sân, de prostată, de colon și rect, vezică urinară, nu sunt prezente în număr suficient de mare în fluidele corporale pentru a fi detectate cu un test de sânge. Cu toate acestea, ele pot elibera substanțe chimice care sunt detectabile în fluidele corporale. (O persoană cu cancer de prostată, de exemplu, poate avea niveluri ridicate de antigen specific prostatei, sau PSA, în sânge).

Originea cancerului poate fi oriunde în corpul uman, conform acestuia, cancerul este clasificat în:

1.                  Carcinoamele, cel mai frecvent tip de cancer, apar din celulele epiteliale. Plămâni, sân, colon, pancreas.

2.                  Sarcoamele sunt cancere care apar în țesuturile conjunctive Oase, cartilaj, țesut conjunctiv și mușchi.

3.                  Limfoame = cancere care apar în țesutul limfatic

4.                  Leucemiile sunt cancere ale celulelor sanguine imature care cresc în măduva osoasă și se acumulează în sistemul circulator.

O prezentare actualizată a incidenței și mortalității diferitelor tipuri de cancer poate proveni din analiza Observatorului Global al Cancerului, unde găsim o descriere exhaustivă a incidenței, prevalenței sau mortalității cancerului pe o perioadă lungă de timp.

Cauzele cancerului

Cancerul este adesea perceput ca o boală care este declanșată fără niciun motiv aparent. În timp ce oamenii de știință nu cunosc încă toate motivele, multe dintre cauzele cancerului au fost deja identificate.

Unele tipuri de cancer se găsesc în anumite familii, dar cele mai multe tipuri de cancer nu sunt în mod clar legate de genele pe care le moștenim de la părinții noștri. Vom învăța în majoritatea despre legăturile complexe dintre gene și cancer, precum și despre testarea genetică și modul în care este utilizată.

Fumatul: Un număr foarte mare de substanțe cancerigene există în tutun. Perioada latentă a cancerului este foarte lungă și apare după 20 de ani de fumat intensiv (mai mult de 3 țigări pe zi). Substanțele chimice și fumul de tigara care provoacă cancerul sunt numite cancerigene. Acestea acționează printr-un proces în mai multe etape care inițiază o serie de modificări genetice (mutații) și stimulează proliferarea celulară. Pot trececâteva decenii după expunerea la agentul cancerigen până la apariția cancerului. De exemplu, tinerii pot face cancer după fumat timp de 20-30 de ani. Aceasta se numește perioada de latență.

Radiații UV: Unii atomi emit radiații, care este energia care călătorește prin spațiu. Expunerea prelungită sau repetată la anumite tipuri de radiații poate provoca cancer. Cancerul cauzat de radiațiile ultraviolete ale soarelui este cel mai frecvent la persoanele care petrec multe ore în lumina puternică a soarelui.

Virusuri: Se estimează că aproximativ 15% din toate cazurile de cancer uman din întreaga lume pot fi atribuite virusurilor, ceea ce reprezintă o parte semnificativă a incidenței cancerului la nivel mondial. Atât virusurile ADN, cât și ARN pot provoca cancer. Virusul Epstein-Barr, virusul papilloma uman, virusul hepatitei B și virusul herpesului uman-8 sunt cele patru virusuri ADN care pot provoca dezvoltarea cancerelor umane. Virusul limfotrop T uman de tip 1 și hepatita C sunt cele două virusuri ARN care contribuie la cancerele umane. Studiul virusurilor și al cancerului uman a dat rezultate încurajatoare pentru dezvoltarea de noi strategii în prevenirea infecțiilor anterioare, care pot duce la carcinogeneză.

Incapacitatea terapiei tradiționale în cancer, cum ar fi chimioterapia și radioterapia, incapabilă să distingă celulele canceroase de celulele normale este un dezavantaj semnificativ și duce la fenomene toxice pentru pacienții care au fost supuși tratamentului. Terapiile țintite împotriva proteinelor virale sau a celor care generează răspunsuri imune, fie pentru a preveni infecția, fie pentru a distruge celulele canceroase sau celulele infectate sunt promițătoare ca strategii mai eficiente și mai tolerabile.

Elementele de bază ale genomului cancerului

Proiectul Genomului Uman (HGP) este un proiect internațional care vizează determinarea secvenței de perechi de baze care formează ADN-ul și cartografierea a aproximativ 20.000-25.000 de gene ale genomului uman. HGP a fost completat pentru a identifica toate bazele din genomul uman și a dezvăluit existența a aproximativ 30.000 de gene. Ca rezultat, oamenii de știință au raportat că genomul uman conține 3164,7 milioane de baze azotate (A, C, T și G). Numărul total de gene este de 30.000, dar mai puțin de 2% din genom codifică proteine. Mai mult, funcția a mai mult de 50% din genele descrise nu este cunoscută. De asemenea, s-a descoperit că aproape (99,9%) nucleotidele sunt identice la om. Cromozomii au, de asemenea, multe alte regiuni necodificate situate în afara genelor. Acestea conțin secvențe repetitive implicate în reglarea expresiei genelor și altele care acționează doar ca spațiere.

Structura Materialului Genetic

Dublu helix (două lanțuri) antiparalele

Structura sub forma unei "scări" (Figura 2)

Figura 2. Structura ADN (urmați linkul pentru alte detalii)

 

Structura este compusă din:

1. Zahar (dezoxiriboză)
2. Grupare fosfat (coloană ADN)
3. Bază azotată
   1. purină (adenină și guanină
   2. pirimidină (citozină și timină)

Genele reprezintă o secvență de nucleotide reprezentând unitatea eredității.

Totalitatea genelor care codifică informațiile este, de asemenea, numită genotip. Fenotipul reprezintă apariția unui organism și este rezultatul interacțiunii dintre expresia genelor și mediul înconjurător.

În cancer, atât genotipul, cât și fenotipul se schimbă permanent.

 Codul genetic și proteinele

Componentele de bază ale unei gene sunt copiate, dar nu toate informațiile vor fi păstrate, deoarece într-o genă există secvențe de baze codificate, dar și secvențe necodificate. Secvențele de codificare se numesc exoni, iar informațiile copiate sunt transmise într-o proteină.

Figura 3. Gene și proteine

Unele proteine ​​sunt lungi și subțiri și formează schela interioară a celulelor, alte proteine, cunoscute sub denumirea de enzime, sunt catalizatori care determină reacțiile chimice. Există sute de mii de proteine ​​în celulele noastre și toate au sarcini precise de îndeplinit. Când o celulă dorește să sintetizeze o anumită proteină, aceasta localizează mai întâi gena, apoi o desface, îi citește secvența, creează o copie a acesteia sub formă de ARN mesager (ARNm) și apoi transportă ARNm-ul din nucleu în citoplasma celulară.

Într-o genă, exonii sunt conservați, în timp ce regiunile numite introni sunt eliminați și degradați de spliceozom. La capătul 5' al fiecărei gene se află promotorul, o secvență necesară pentru inițierea sau oprirea transcrierii. Mai departe sunt localizate regiunile de activare si care determină activarea unei gene. Când o genă este activată, provoacă formarea unei proteine. Acest proces începe prin formarea unei molecule intermediare numite ARN mesager (ARNm). Pentru transferul informațiilor de la ADN la ARNm, se utilizează împerecherea bazelor azotate. De exemplu, o adenină din ADN se împerechează cu un uracil din ARNm. ARNm traversează nucleul și ajunge în citoplasmă la ribozomi, care îi asamblează în proteine. Genele există în mai multe varietăți numite alele, unele mai dominante decât altele. Înainte ca ARNm să iasă din nucleu, are loc prelucrarea acestuia. Regiunile care nu sunt implicate în construcția proteinelor, numite introni, sunt tăiate, astfel încât ARN-ul matur ajunge la ribozomii care conțin numai exonii. Procesul de construcție a proteinelor din ARNm se numește traducere. Traducerea perechilor de baze din ADN în proteine depinde de tripletul nucleotidelor din ARNm. Fiecare triplet de nucleotide numit codon codifică un singur aminoacid și, în final, un lanț de aminoacizi codifică proteinele. Deoarece ADN-ul are doar 4 perechi de baze într-o genă, sunt posibile 64 de combinații pentru codificarea a 20 de aminoacizi. Ca urmare, codul este redundant. Există 60 de tripleți pentru 19 aminoacizi, 3 tripleți pentru oprire, 1 triplet pentru metionină și 20 de aminoacizi care semnalează "start". Ca rezultat, un aminoacid este codificat de mai mult de un triplet.

 Mutații genetice

Când o genă conține o mutație, este foarte probabil ca proteina codificată de această mutație să fie anormală. Uneori este posibil ca proteina să funcționeze normal, dar imperfect. În alte cazuri, proteina va fi complet inactivată.

Toate mutațiile reprezintă modificări ale secvenței de bază a aminoacizilor. Aceste mutații pot apărea în regiunile de codificare și în cele care nu codifică. Ca rezultat, mutațiile intronilor sunt silențioase, deoarece nu codifică proteinele. Mutațiile pot implica o modificare a unei singure perechi de baze sau pot implica regiuni mai mari. Majoritatea cazurilor de cancer se datorează mutațiilor genetice care se acumulează în celulele corpului în timpul vieții. Acestea se numesc mutații somatice, iar genele implicate sunt localizate în autozomi (cromozomi nonsexuali). Cancerul se poate datora, de asemenea, mutațiilor cromozomilor sexuali din ouă sau spermatozoizi. Acestea sunt mutații ale liniei germinale și pot apărea de nuovo (pentru prima dată) sau pot fi dobândite în viața adultă. Fiecare copil din aceasta familie are 50% sanse sa sufere de alela afectata si implicit sa inerenteze boala. În bolile în care apar mutații în genele susceptibile de a fi implicate în cancer, crește susceptibilitatea oamenilor la această boală. De nouvo este o nouă mutație care apare într-o celulă germinală și este transmisă generațiilor următoare. Aceste mutații sunt specifice anumitor tipuri de cancer. De exemplu, retinoblastomul se caracterizează printr-o mutație în cromozomul 13, care arată o ștergere a unei gene care codifică proteina Rb. Polipoza adenomatoasă familială (PAF) este o afecțiune moștenită în care se formează numeroși polipi adenomatoși în principal din epiteliul intestinului gros. În timp ce acești polipi sunt inițial tumori benigne, transformarea lor în tumori maligne (cancer de colon) are loc atunci când este lăsată netratată. Există trei variante ale bolii: PAF și PAF atenuat (numit inițial sindrom ereditar de adenom plat) sunt cauzate de mutații ale genei APC pe cromozomul 5, în timp ce boala autozomală FAP recesivă (sau polipoză MYH) este cauzată de mutații ale genei MUTYH pe cromozomul 1. Dintre cele trei, FAP în sine este cea mai severă și comună; Deși pentru toate cele trei, rezultatul este apariția polipilor în colon și apariția cancerului de colon sunt limitate la peretele colonului și îndepărtarea lor poate reduce foarte mult răspândirea cancerului.

Majoritatea cancerelor umane apar din cauza acumulării de mutații somatice. Mutațiile somatice nu sunt transmise generației următoare. Dar o viață lungă oferă terenul pentru apariția unui număr suficient de mare de erori. Dintr-o singură celulă cu informații eronate poate apărea o clonă.

 Variabilitatea genetică

Un bărbat care bea alcool și fumează trăiește până la vârsta de 90 de ani, fără a suferi cancer la ficat sau la plămâni; un altul care fumează și ingerează aceeași cantitate de compuși cancerigeni va avea cancer la vârsta de 60 de ani.

Cancerul de sân la o femeie răspunde la chimioterapie și tumora se micșorează; cancerul de sân al unei alte femei nu arată nicio modificare după același tratament.

Cum pot fi explicate aceste diferențe?

Ca și diabetul, bolile de inimă sau afecțiunile renale cancerul este o boală complexă, toate apărând din combinațiile modificărilor care apar în aceeași celulă într-o perioadă de timp. În cancer, aceste schimbări se acumulează de-a lungul multor ani. Doar atunci când apare un număr critic de modificări în aceeași celulă, aceasta în cele din urmă tumorală.

Pentru a complica lucrurile în continuare, există multe tipuri diferite de cancer, fiecare prezentând diferite combinații ale acestor modificări. Chiar și într-un singur tip, cum ar fi cancerul pulmonar sau cancerul de colon, clinicienii pot identifica subtipuri, fiecare marcat bi un set unic de schimbări.

Cum pot cercetatorii spera sa identifice și sa studieze toate schimbarile care apar in atatea forme de cancer?

Cum pot explica de ce unii oameni răspund la tratament și nu alții?

Cum pot explica de ce unii fumători fac cancer pulmonar, iar alții nu?

Un aspect uimitor al genomului uman este că există o variație (variabilitate) atât de mică în secvența ADN atunci când genomul unei persoane este comparat cu al alteia. Din cele 3,2 miliarde de baze, aproximativ 99,9% sunt aceleași la două persoane. Variația apare în fracția de baze azotate rămase din genom, 0,1% - aproximativ câteva milioane de baze – iar aceasta face ca o persoană să fie unică. Această cantitate mică a variabilității determină cum arată o persoană sau bolile pe care le dezvoltă. Variația apare ori de câte ori ordinea bazelor într-o secvență ADN se modifică. Variațiile pot implica doar o bază sau mai multe baze. Una sau mai multe nucleotide pot fi modificate, adăugate sau eliminate. În cromozomi, aceste modificări se numesc polimorfisme, inserții și deleții.

În plus față de aceste modificări, unele secvențe ADN numite secvențe repetitive introduc copii suplimentare ale lor de mai multe ori. Cromozomii pot suferi, de asemenea, schimbări mai dramatice numite translocații. Acestea apar atunci când o întreagă secțiune a ADN-ului pe un cromozom comută locurile cu o secțiune pe alta.

Nu toate variațiile din secvențele ADN ale genomului au un efect. Printre variațiile care produc efecte, unele sunt mai grave decât altele. Rezultatul depinde de doi factori: unde, în genom, apare schimbarea (adică, într-o regiune necodificată, codificatoare sau reglatoare) și natura exactă a schimbării.

Cele mai multe variații ale genomului uman nu au niciun efect cunoscut deoarece ele apar în regiunile necodificate ale ADN-ului. În plus, există unele modificări care apar în regiunile de codificare și de reglementare, dar ele nu au efect cunoscut. Toate acestea sunt variații silențioase.

Cea mai comună variație de secvență din genomul uman este substituția stabilă a unei singure baze azotate, adică polimorfismul unei singure nucleotide (SNP, denumit în română snip). Prin definiție, un SNP are o frecvență redusă a alelelor, mai mare de 1% în cel puțin o populație a lumii (Risch, 2000). Majoritatea SNP sunt „silențiateˮ și nu alterează funcționarea expresiei genei respective. Atunci când apare un SNP în cadrul unei regiuni codificatoare, există posibilitatea ca acest eveniment să nu aibă nicio influență asupra codificării aminoacidului. De exemplu, atunci când secvența GAC din structura ADN devine GAG, codonul din ARNm se schimbă din CUG în CUC. Întrucât ambii codoni codifică pentru același aminoacid și anume leucina (Leu), nu va avea loc nicio schimbare în proteina respectivă. Modificarea care are loc în ADN este numită modificare silențiată.

Este de înțeles, cu o oarecare reticență, că termenul de mutație definește variațiile rare cu penetranță ridicată, de obicei asociate cu un fenotip defavorabil, cum sunt maladiile monogenice recunoscute (de exemplu boala celulelor în formă de seceră – siclemia sau hemofilia). În primă instanță, în acest eseu, atenția va fi ațintită asupra SNP-urilor cu penetranță scăzută în populație și fără efecte fenotipice.

Unele dintre variațiile care apar în regiunile de codificare și de reglare a genelor au efecte inofensive. Ei pot, de exemplu, schimba modul în care o persoană arată. Unii oameni au ochi albaștri, alții căprui; unii sunt înalți, alții scunzi; iar unele fețe sunt ovale, altele rotunde. Alte variații în regiunile de codificare sunt inofensive deoarece apar în regiunile unei gene care nu afectează funcția proteinei produse.

Există un grup de variații în regiunile de codificare și de reglare care duc la efecte dăunătoare. Acestea sunt numite mutații. Ele cauzează boala, deoarece schimbarile intervenite în instructiunile genomului modifica functiile proteinelor importante implicate în menținerea sănătății. De exemplu, diabetul, cancerul, bolile de inimă, boala Huntington și hemofilia rezultă toate din variațiile care cauzează efecte dăunătoare.

Într-o boală "simplă", cum ar fi hemofilia, variația unei gene este suficientă pentru a provoca simptomele bolii. Prin contrast, într-o boală "complexă", cum ar fi cancerul, simptomele sunt observate numai după ce au avut loc variații ale mai multor gene din aceeași celulă.

În final, există variații genetice care au efecte "latente". Aceste variații, găsite în regiunile de codificare și reglatorii, nu sunt în sine dăunătoare, iar schimbarea fiecărei gene devine evidentă în anumite condiții. Astfel de schimbări pot cauza eventual unii oameni să fie expuși unui risc mai mare de cancer, dar numai după expunerea la anumiți agenți de mediu. Ele mai explică de exemplu faptul că o persoană răspunde la un tratament medicamentos în timp ce alta nu.

Exemplu: din două persoane fumătoare și consumatoare de alcool doar una dintre va face cancer. O privire mai atentă la cromozomii acestor doi bărbați arată doar o eșantionare diferită a variațiilor care sunt responsabile pentru riscul individual de cancer. Variațiile în sine nu cauzează cancer, ci afectează acea persoană cu risc crescut la tutun și alcool după expunere.

Cea mai comună formă de variație genetică, un SNP este definită ca o modificare a unei baze azotate într-o secvență ADN care are loc într-o proporție semnificativă (mai mult de 1%) a unei populații mari. Baza azotatată este înlocuită de oricare din celelalte trei baze. Iată un exemplu: În secvența ADN TAGC, un SNP apare atunci când guanina se modifică la citozină, iar secvența devine TACC. SNP-uri pot explica, de asemenea, de ce unii pacienți răspund bine la un anumit tratament medicamentos, în timp ce alții au un răspuns minim sau nu. SNP-uri pot fi, de asemenea, implicate atunci când pacienții au efecte secundare diferite ca răspuns la același medicament. Multe proteine interacționează cu medicamentul, afectează transportul acestuia în organism, absorbția în țesuturi, metabolismul în forme mai active sau producțiile toxice și excreția. Dacă un pacient are SNP-uri în unul sau mai multe dintre aceste proteine, acestea mai modifică timpul în care organismul este expus formelor active ale medicamentului sau ale oricăror produși toxici ai acestuia.

Oamenii de știință cred ca snipurile ii pot ajuta sa răspundă la aceste întrebări și să catalogheze seturile unice de schimbari implicate în diferite forme de cancer. Ei văd SNP-urile ca un instrument potențial pentru îmbunătățirea diagnosticării cancerului și a planificării tratamentului și suspecteaza că SNP-urile mai joacă un rol in diferitele raspunsuri la tratamente observate în randul pacientilor cu cancer.

Cred că SNP-uri pot fi, de asemenea, implicate în diferitele niveluri ale riscului individual de cancer observat.

Cum sunt snipurile implicate în atâtea aspecte diferite ale sănătății?

Pentru a răspunde la aceste întrebări, trebuie mai întâi să privim genomul uman.

SNP-uri sunt variații foarte frecvente împrăștiate în genom. Deoarece acestea sunt destul de ușor de măsurat și sunt, de asemenea, remarcabil de stabile, fiind moștenite de la o generație la alta, ele au devenit utile ca markeri ai anumitor gene. Dacă un SNP special este localizat lângă o genă, atunci de fiecare dată când gena este trecută de la mamă la copil, SNP este transmis de asemenea. Acest lucru permite cercetătorilor să presupună că atunci când găsesc același SNP într-un grup de genomuri individuale, gena asociată este prezentă și ea.

Oamenii de știință încearcă să identifice toate SNP-urile diferite din genomul uman. Acest luc ru poate fi realizat prin secvențierea genomului unui număr mare de persoane și apoi compararea secvențelor de bază pentru a descoperi SNP-uri. Datele secvenței sunt stocate în computere care pot genera o singură hartă a genomului uman care conține toate SNP-urile posibile.

Genomul fiecărui individ conține propriul model de SNP-uri. Astfel, fiecare individ are propriul său profil SNP. Când oamenii de știință se uită la toate modelele de la un număr mare de oameni, pot să le organizeze în grupuri. Medicii speră ca prin studierea profilurilor SNP în populații, vor apărea corelații între anumite profiluri SNP și răspunsurile specifice la tratamentul cancerului.

În viitor, după ce un doctor a diagnosticat cancerul de sân la un nou pacient poate solicita un profil SNP și să utilizeze informațiile pentru a-și sfătui pacientul în legătură cu opțiunile de tratament.

Deoarece SNP-uri pot fi markeri genetici, profilurile SNP pot ajuta oamenii de știință să identifice întreaga colecție de gene care contribuie la dezvoltarea bolilor complexe, cum ar fi cancerul. De exemplu, oamenii de știință vor examina profilurile SNP de la mulți oameni, inclusiv pacienții cu cancer de colon. În cadrul numeroaselor profiluri diferite, ei pot descoperi un mic subset de SNP-uri care sunt prezente numai la pacienții cu cancer de colon. Acest lucru ar implica faptul că acest subset de SNP-uri este asociat numai cu cancerul de colon, astfel încât SNP-urile în sine pot fi considerate markeri pentru genele cancerului de colon.

Oamenii de știință folosesc, de asemenea, SNP-uri pentru a calcula factorii de risc asociați cu cancerul la populații mari.

În primul rând, imaginați-vă analizarea SNP-urilor într-o populație aleatoare de 100 de persoane. Optzeci la suta se constată că au SNP A, iar restul de 20% au SNP B. Acum, dacă ne uităm la alte 100 de persoane, toate cu cancer renal. În acest grup, 60% au SNP A și 40% au SNP B. Nici SNP A, nici SNP B nu cauzează cancer. Cu toate acestea, din aceste date, medicii pot spune că o persoană care are SNP B are un risc mai mare pentru cancerul de rinichi decât o persoană cu SNP A.

Oncogene și gene supresoare tumorale

Un grup de gene implicate în dezvoltarea cancerului sunt denumite oncogene. Prezența lor sau activitatea lor exacerbată provoacă apariția cancerului. Când oncogenele sunt în celula normală, oferă instrucțiuni pentru creșterea normală a celulelor; Ele sunt numite proto-oncogene în acest caz. Cele mai descrise oncogene până acum sunt cele care codifică factorii de creștere, receptorii factorului de creștere, factorii de transcriere și proteinele implicate în reglarea ciclului celular. Genele supresoare tumorale sunt o familie de gene normale care informează celula să producă proteine care restricționează creșterea și dezvoltarea aberantă a celulelor. Sunt ca frâna unei mașini. Dacă aceste gene suferă mutații, este ca și cum frâna nu mai funcționează corect și creșterea și dezvoltarea nu mai pot continua. Dacă o genă tumorală supresoare este mutantă sau inactivă, aceasta poate provoca cancer. Cei cu risc crescut de a dezvolta cancer au, de obicei, o copie defectă a unei gene suprimatoare. Deoarece genele provin în perechi de la ambii părinți, existența unuia nu duce neapărat la cancer. Dar dacă a doua copie este supusă unei mutații, crește riscul de cancer.

Testul genetic implică examinarea ADN-ului unei persoane - de obicei din celule prelevate dintr-o probă de sânge - pentru mutații legate de un tip de cancer. Unele teste genetice pot identifica modificări ale întregului cromozom. Alții examinează porțiuni scurte de ADN din gene. Cu toate acestea, alții caută proteine codificate de gene presupuse a fi defecte. Testele genetice servesc mai multor scopuri. Acestea sunt utilizate pe scară largă pentru screening-ul nou-născuților pentru o varietate de boli. Adesea, aceste informații permit medicilor să minimizeze problemele cauzate de mutație. În oncologie, medicii folosesc testarea pentru a diagnostica genele implicate în cancer, pentru a clasifica cancerul în subtipuri sau pentru a prezice reacția unui pacient la noi tratamente. Oamenii de știință care căutau boli cauzate de modificări genetice au început prin studierea probelor colectate de ADN de la "familii predispuse", în care numeroase rude, de-a lungul mai multor generații, au dezvoltat această boală. Terapiile care pot fi utilizate pentru a corecta expresia sau chiar mutațiile care apar într-o genă sunt în mare parte la nivel experimental. Cu toate acestea, cel puțin una dintre ele, și anume terapia genică de substituție, este aplicată cu succes. În casetele 1 și 2 sunt prezentate două proteine codificate de două gene reprezentative pentru clasa lor: gena Rb și gena p53 care sunt gene supresoare tumorale.

 S-a stabilit că inactivarea Rb prin fosforilare, o mutație sau interacțiunea cu oncoproteinele virale duce la activarea E2F, facilitând astfel progresia ciclului celular.

Intermediat de Rb, oprirea activității E2F implică recrutarea unei varietăți de co-supresoare de transcriere și proteine de remodelare a cromatinei, inclusiv histon deacetilaza, ADN metil-tranferaza și proteina Brg / Brm cu rol de remodelare a cromatinei. Inactivarea Rb prin fosforilare secvențială în timpul desfășurării cilcului celular duce la disocierea acestui represor de Rb (E2F), facilitând transcrierea. În concluzie, în timpul progresiei normale a ciclului celular, Rb este inactivator într-o cascadă de evenimente de fosforilare care duc la disocierea proteinelor asociate cu Rb. Aceste evenimente de fosforilare sunt bine reglate într-un mod dependent de semnal printr-un mecanism care include cicline, kinaze dependente de ciclină și inhibitori de kinază dependenți de ciclină.

Multe situații de susceptibilitate la cancer sunt eterogene din punct de vedere genetic. Aceasta înseamnă că diferite mutații (genotipuri) pot fi exprimate ca un singur fenotip. Aceste mutații pot fi localizate pe aceeași genă sau pot fi localizate pe locusuri diferite (eterogenitatea locusurilor) sau pe gene diferite (eterogenitatea alelelor). De exemplu, cancerul de sân ereditar și cancerul ovarian au atât eterogenitate alelică, cât și eterogenitate locus. Mai mult de 500 de mutații au fost observate în gena BRCA1 pe cromozomul 17 și cresc riscul de cancer de sân. Mai mult de 300 de mutații ale genei BRCA2 pe cromozomul 13 sunt asociate cu cancerul ovarian.

BRC (susceptibilitatea la cancerul de sân) A1 responsabil pentru repararea ADN-ului.

A2: o genă represoare tumorală.

Oncogene virale

Rous este primul savant care a demonstrat că virusurile pot produce cancer. A dovedit că un virus (virusul sarcomului Rous) poate cauza cancer la galinacee (1911). Pentru această descoperire F.P.Rous a câștigat Premiul Nobel în 1966.

În 1909, Rous și-a început studiul unui sarcom care a apărut în mușchiul din piptul unei găini. În experimentele inițiale, Rous a reușit să transmită tumora prin implantare de mici fragmente din acesta în alte păsări din aceeași rasă. Mai târziu, ca o variație a în acest experiment, el macerat un fragment de sarcom cu nisip și a filtrat omogenatul. Când a injectat filtratul rezultat în păsările tinere, acestea tumori s-au dezvoltat foarte repede, uneori în câteva săptămâni. Ulterior a constatat că aceste tumori induse ar putea fi, de asemenea, omogenizate pentru a produce, încă o dată, un agent infecțios care ar putea fi transmis și altor păsări, care au dezvoltat și sarcoame la locurile de injectare. Aceste pasaje seriale ale agentului care induce sarcomul de la un animal la altul a dat o serie de concluzii care sunt evidente pentru noi acum, dar la acel moment erau revoluționare. Agentul cancerigen, indiferent de natura sa, era clar foarte mic, deoarece ar putea trece printr-un filtru. Prin urmare, a fost un viru . Acest virus ar putea provoca apariția unui sarcom la un pui injectat, făcând acest lucru într-un interval de timp previzibil. Un astfel de agent infecțios a oferit cercetătorilor ocazia unică să inducă la animale sau la oameni cancer prin intermediul virusurilor.

Renașterea cercetării virusului sarcomului Rous a început în mare măsură la Institutul din California de tehnologie în Pasadena, în laboratorul lui Renato Dulbecco. Postdoctorand al lui Dulbecco colegul Harry Rubin a constatat că atunci când au fost introduse stocurile de RSV in vase Petri pe care s-au cultivat fibroblaste din embrioni de pui, celule infectate cu RSV au supraviețuit, aparent la infinit. Se părea că RSV parazita aceste celule, forțându-le să producă un flux constant de particule virale descendente timp de multe zile, săptămâni, chiar luni.

Prin 1913, danezul Johannes Grib Fibiger a raportat că cancerele de stomac la șobolani ar putea să fie datorate unor viermi spiroptere. Lucrarea sa, pentru care a primit Premiul Nobel pentru fiziologie și medicină din 1926, a reprezentat o validare directă și puternică a ideii, indicată pentru prima dată de lucrarea lui Rous, că cancerul era încă un alt exemplu de boală infecțioasă. La un an după ce Fibiger a murit conceptul acesta a început să se dezintegreze. Tumorile de stomac pe care le descrisese nu erau deloc tumori. În schimb, s-au dovedit a fi epitelii metaplastice stomacale care au fost rezultatul deficiențele profunde de vitamine suferite de acești șobolani; locuiau în rafinării de zahăr și a mâncat trestie de zahăr aproape exclusiv. Premiul Nobel al Fibiger a devenit o jenă a comunității încă mici de cercetători în domeniul cancerului. Au aruncat proverbialul copil afară cu apa de baie, discreditând atât munca sa, cât și noțiunea că cancerul ar putea fi cauzat de agenți infecțioși.

Exemplu: Infecția cu HPV

Infecția cu HPV începe în stratul bazal al epiteliului stratificat scuamos, în care inițial E1 și E2 preiau controlul replicării ADN-ului viral într-un număr mic de copii. Mai tarziu, când celulele bazale se diferențiază pentru a forma epiteliul suprabazal, replicarea genomului viral trece la un număr mare de copii. Apoi, virionii eliberați produc descuamarea epiteliului, provocând infecție în celulele învecinate. Genomul HPV poate fie să se integreze în genomul gazdei, fie să rămână într-un forma epizomală. Aproximativ 83% din cancerul de col uterin HPV-pozitiv prezintă dovezi ale integrării genomului HPV în celula gazdă (Burk și colab., 2017). Integrarea genomului viral în genomul gazdei, duce frecvent la perturbarea Situsului genei E2. Gena E2 este responsabilă de reprimarea E6 și E7. Surpimarea ei duce la activarea E6 și E7 si integrarea genomului în genomul gazdă. Pe tot parcursul infecției, activitatea E6 și E7 sunt responsabile pentru multiplicarea genomului viral cu ajutorul mașinăriei celulare așa cum au relevat mai multe analize cu interatomi (Neveu et al., 2012; White și colab., 2012a,b). Ei pot păcăli celulele să devină tumorale în procesul de replicare virală.

Pe lângă vaccinurile profilactice, pin care se activează sistemul imunitar al organismului pentru a preveni apariția cancerului de col uterin cercetarea clinică modernă se concentrează pe dezvoltarea de vaccinuri terapeutice, care pot fi utilizate pentru trata cancerul chiar și în stadii avansate de malignitate. spre deosebire de vaccinuri preventive care sunt dezvoltate împotriva L1 sau L2 proteinele capsidelor care sunt inactivate sau șterse în timpul integrarea genomului HPV în genomul celular, vaccinurile terapeutice vizează oncoproteinele E6 și E7, care sunt exprimate pentru o perioadă mai lungă în ciclul de viață al HPV și reprezintă cel mai important semn distinctiv dintre oricare celulă infectată cu HPV.

Urmați linkul și explicați modul în care virusul ADN Papilloma provoacă cancer.

Terapii HPV

În plus față de vaccinurile profilactice, care activează sistemul imunitar al organismului pentru a preveni cancerul de col uterin, cercetarea clinică modernă se concentrează pe dezvoltarea vaccinurilor terapeutice, care pot fi utilizate pentru tratarea cancerului chiar și în stadii avansate de malignitate. Spre deosebire de vaccinurile preventive care sunt dezvoltate împotriva proteinelor capsidă L1 sau L2 care sunt inactivate sau șterse în timpul integrării genomului HPV în genomul celular, vaccinurile terapeutice vizează oncoproteinele E6 și E7, care sunt exprimate pentru o perioadă mai lungă în ciclul de viață HPV și reprezintă cel mai important semn distinctiv al oricărei celule infectate cu HPV.

Mecanisme de transformare celulară prin retrovirusuri

1. Transducția retrovirală a oncogenei (transducția retrovirusului) = absorbția unei gene celulare (protooncogenă) de către virus
2. Activare oncogenă prin inserție retrovirală (retrovirus cu acțiune cis)
3. Oncogeneza mediată de proteinele esențiale ale retrovirusurilor (retrovirus cu latență lungă care transactivează)

Terapia genică

Progresele în biotehnologie au adus terapia genică în prim-planul cercetării medicale. De-a lungul timpului, au fost dezvoltate metode fiabile de transfer și exprimare a diferitelor gene la nivelul celulelor țintă, folosind vectori virali. Astfel, au apărut două abordări principale: modificarea in vivo și modificarea ex-vivo, pentru care, cele mai potrivite organisme celulare sunt retrovirusurile și adenovirusurile. Vectorii non-virali sunt mult mai puțin eficienți decât cei virali, dar au anumite avantaje datorită imunogenității și capacității lor mari în terapie.

Considerate a fi simple forme de viață, virusurile servesc ca vectori naturali foarte dezvoltați pentru transferul de informații genetice în interiorul celulelor. Această sarcină a lor a condus la încercarea de a utiliza vectori virali recombinanți pentru eliberarea genelor terapeutice în diferite țesuturi afectate.

Terapia genică umană este o disciplină inovatoare, fiind o completare eficientă la numeroase abordări ale bolilor din corpul uman. Promite să schimbe practica în medicină, tratând cauza afecțiunii și nu simptomele acesteia.

Vectorii adenovirali au furnizat un sistem adecvat pentru studii privind expresia genelor și aplicațiile terapeutice. Experimentele recente în dezvoltarea vectorilor adenovirali s-au concentrat asupra tropismului virusurilor, acomodându-se cu gene mai mari, crescând stabilitatea și controlul expresiei genelor.

Terapia genică folosind vectori adenovirali se află într-un stadiu incipient, iar toate studiile efectuate se bazează pe experimente, scopul fiind siguranța și eficacitatea procedurilor.

Există două tipuri de terapie genică:

1.                  Terapia cu linii germinale

2.                  Terapia genică a liniei somatice

Terapia cu linii germinale

În acest caz, gameții sunt modificați prin introducerea genelor funcționale în genomul lor. Astfel, schimbările datorate terapiei genice vor putea fi, de asemenea, transmise generațiilor viitoare.

Terapia genică a celulei somatice

Terapia de substituție

Aceasta constă în izolarea celulelor din țesutul afectat, în care va fi introdus un vector. Acesta conține gena sănătoasă și va pătrunde în nucleul celulei, pentru a înlocui gena disfuncțională. Următorul pas este că celulele corectate sunt introduse în pacient. Nici o schimbare sau efect al acestei terapii nu va putea fi transmis generațiilor viitoare.

Anumite virusuri sunt folosite ca vectori, deoarece pot livra noua genă prin infectarea celulei afectate. Unele tipuri de virusuri, cum ar fi retrovirusurile, își integrează materialul genetic (inclusiv noua genă) într-un cromozom din celula umană. În schimb, adenovirusurile își introduc ADN-ul în nucleul celulei, care nu este integrat într-un cromozom.

Vectori

Vectorul poate fi introdus prin injectare sau prin perfuzii direct într-un țesut specific al corpului, de unde este luat de celule individuale. Acest lucru se poate face și în laborator, luând celule de la pacient și punându-le în contact cu vectorul. Următorul pas este introducerea celulelor care conțin vectorul în organismul pacientului. În acest fel, dacă tratamentul dă roade, noua genă, eliberată de vector, va produce o nouă proteină funcțională.

Un vector ideal trebuie să fie foarte specific, capabil să livreze în mod eficient una sau mai multe gene. Nu trebuie să fie recunoscută de sistemul imunitar al gazdei. În acest sens, odată introdus în organismul pacientului, vectorul nu are voie să declanșeze o reacție alergică sau o inflamație. Un alt aspect important este că vectorul trebuie să fie capabil să exprime acea genă atât timp cât este necesar, în general pe tot parcursul vieții pacientului.

Se folosesc două tehnici de introducere a vectorului în corpul pacientului:

1.                  Tehnica in vivo.

2.                  Tehnica ex-vivo

Cea mai utilizată tehnică in vivo, care utilizează celule extrase de la pacient. În prima etapă, genele normale sunt extrase și clonate. Mai mult, celulele afectate luate de la pacient sunt puse în contact cu vectorii. Și, în cele din urmă, celulele corectate sunt reintroduse în corpul pacientului pentru a produce proteine funcționale care luptă împotriva bolii în cauză (fig. 4).

În cazul tehnicii ex-vivo , celulele prelevate de la pacient nu sunt utilizate. Se dau vectori care conțin gena normală, intravenos. Acestea se vor deplasa spre țesutul / celulele țintă (Fig. 5).

Figura 4. Tehnica ex-vivo și tehnica in vivo.

Vectori virali

Virusurili sunt cel mai adesea folosite ca vectori, deoarece au dezvoltat o modalitate de a capta și transmite genele lor celulelor umane, în cazuri patogene. Cercetătorii au încercat să profite de această proprietate și să manipuleze genomul viral pentru a-l înlocui cu gene umane funcționale. Unele virusuri își introduc propriile gene în genomul gazdei fără a intra în celulă, în timp ce altele penetrează membrana celulară. Odată ce gena este introdusă în celula umană, sinteza proteinelor este afectată.

Transformarea unui virus într-un vector

Ciclul de viață al unui virus poate fi împărțit în două faze distincte: infecție și replicare. Infecția este rezultatul introducerii genomului viral în celula gazdei. Aceasta duce la o fază timpurie a expresiei genelor, caracterizată prin apariția produselor de reglare virală, urmată de o fază târzie, când genele structurale sunt exprimate și apare formarea de noi particule virale. În terapia genică vectorială, particulele virale încorporează un genom modificat care conține o genă terapeutică în locul genomului viral. Transducția este definită ca o infecție non-replicativă, care introduce informații genetice funcționale, exprimate prin vectori recombinanți în celula țintă. O altă metodă de terapie ar putea fi editarea genomică.

Editarea genomică e în cancer

Editarea genomică este o modalitate specifică și precisă de modificare a ADN-ului unei celule / organism. Spre deosebire de terapia genică convențională, care utilizează în principal vectori virali care sunt inserați aleatoriu în genom, editarea genomică utilizează enzime cunoscute sub numele de nucleaze programabile care corectează defectul la locul de origine, fără a influența alte gene. Editarea genomică utilizează tehnologii prin care o secvență mutantă de ADN este modificată și secvența normală este restaurată.

Editarea se poate face atât în celulele somatice mature, cât și în cele embrionare. Cu toate acestea, este de preferat manipularea celulelor somatice prin această tehnică, în special din cauza implicațiilor etice care apar în cazul utilizării celulelor embrionare, dar și din cauza unei mari dificultăți în procurarea acestora. Fundamentul editării genomice se referă la producerea ghidată a unei rupturi bicatenare a ADN-ului cu ajutorul nucleazelor programabile obținute prin tehnici de inginerie genetică. Ruptura activează mecanismele normale de reparare a ADN-ului celular care restabilesc secvența normală prin modificări precise: adăugarea, excluderea sau înlocuirea unor nucleotide.

Cele două tipuri de procese reparatorii care apar sunt: recombinarea omoloagă (HR) – mecanism precis care utilizează pentru reparare catena ADN intactă pe cromozomul cromatic soră sau pe cromozomul omoloag, și unirea neomoloagă a capetelor (NHEJ) – mecanism predispus la erori (inserții/deleții), capetele rupte ale ADN-ului fiind unite fără omologie sau cu ajutorul unor secvențe omoloage scurte (10 pb). Există 3 tipuri de sisteme utilizate în editarea genomică: ZNF (nucleaza domeniului care leagă sub formă de deget), TALEN's (nucleazele efectoare asemănătoare activatorului de transcriere) și CRISPR-Cas9 (cele mai utilizate și cele mai cunoscute).

Sistemul CRISPR-Cas9 este cunoscut ca fiind un așa-numit "sistem imunitar specific" al bacteriilor, descoperit pentru prima dată în specia Streptococcus pyogenes. Cercetătorii au observat existența unui sistem enzimatic în celula bacteriană, care, în momentul infectării sale cu un bacteriofag, își scindează secvența ADN și introduce în anumite locuri specifice din cromozomul bacterian anumite secvențe de ADN viral. În cazul unei infecții viitoare cu același bacteriofag, enzima din acest sistem, ghidată de un ARN complementar secvenței ADN virale inserate în cromozomul bacterian, va identifica acea secvență în genomul bacteriofagului și o va stânjeni. Numele acestui sistem vine de la cel al secvențelor specifice din genomul bacterian (CRISPR = Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats, Cas-9 = asociat cu nucleaza 9). Sistemul CRISPR-Cas9 are 2 componente: o secvență ARN ghid – ARN complementar ADN-ului țintă, acest ARN recunoscând și legându-se în vecinătatea secvențelor specifice (PAM (protospacer adjacent motif) și o enzimă – endonucleaza cas9, care poate fi modificată în diferite scopuri.

Sistemul CRISPR-Cas poate fi utilizat în diverse strategii terapeutice, cum ar fi:

1. Sistemul clasic CRISPR-Cas9 – nucleaza induce o breșă bicatenară, celula repară ruptura și astfel se introduce gena normală.

2. Sistemul CRISPR-Cas9 cu o enzimă Cas9 modificată inactivă care se fixează pe un anumit loc și blochează transcripția (oncogene).

3. Sistemul CRISPR-Cas9 la care se adauga o proteina activatoare a expresiei genice, amplificarea expresiei genei respective (supresor genetic al tumorilor).

4. Imunoterapia cancerului – introducerea genelor care stimulează activitatea limfocitelor T și le ghidează spre eliminarea celulelor tumorale.

Un exemplu de aplicare a sistemului CRISPR-Cas9 în tratamentul cancerului indus viral. Una dintre cele mai frecvente și periculoase forme de cancer întâlnite la femei este cancerul de col uterin, a cărui apariție este indusă în majoritatea cazurilor de infecția cu virusul HPV (Human Papilloma Virus). Aaest virus exprimă o serie de oncogene virale: E6 (silențierea sa duce la reactivarea căii p53 care duce la senescență celulară și apoptoză), E7 (silențierea sa duce la restabilirea căii de semnalizare pRb care duce la instalarea senescenței celulare), E5 (mai rar). Celulele tumorale cervicale necesită expresia genelor E6 și E7 pentru a supraviețui.

Pentru tratamentul acestui tip de cancer prin terapia clasică, au fost încercate diferite strategii:

1. Introducerea în celule a peptidelor antagoniste pentru E6 și E7

2. Reintroducerea genei normale Tp53 în celulele tumorale

3. Utilizarea ARN-ului interferent

1. Din spectrul strategiilor care au implicat CRISPR-Cas9, putem amintiLinii de celule tumorale cervicale infectate cu HPV 16 sau 18, CRISPR-Cas9 restabilește nivelul celular al p53 și pRb inducând apoptoza.
2. Țintirea regiunii aproape 3'UTR a l1 care codifică regulatorii genelor care codifică proteinele capsidei virale extrem de imunogene, inducând dezvoltarea unui răspuns imun intens.
3. Promotorul P97 care vizează situat în amonte de gena E6, ceea ce duce la reducerea la tăcere a genei.

Un alt exemplu de utilizare a sistemului CRISPR-Cas9 este tratamentul infecției latente cu EBV (virusul Epstein-Barr), care poate duce la apariția limfomului Burkitt sau a carcinomului nazofaringian. Genele virale implicate în transformarea malignă sunt: EBNA1/2 (EBV nuclear Ag), LMP1/2 (membrane proteice latente). Strategiile bazate pe Crispr-Cas9 au fost aplicate celulelor de la pacienții cu limfom Burkitt. În urma editării genomice, s-a constatat că reduce proliferarea celulară și reduce încărcătura virală (elimină aproape complet virusul). De asemenea, infecția cu VHB (virusul hepatitei B) a reprezentat un domeniu de interes pentru dezvoltarea strategiilor de tratament folosind CRISPR-Cas9 datorită rezistenței la tratamentul medicamentos clasic datorită structurii cccADN a genomului viral. Sistemul CRISPR-Cas9 s-a dovedit a fi ideal pentru inactivarea genelor virale.

Alte tipuri de cancer tratabile folosind CRISPR-Cas9: carcinomul Merkel (poliomavirusul cu celule Merkel) și sarcomul Kaposi (indus de infecția cu virusul herpetic uman 8). Recent, au fost dezvoltate sisteme efectoare CRISPR C2C2 pentru virusurile ARN (HCV, virusul limfotrofic IT) care efectuează editarea ARN, nu ADN.

Trăsăturile (caracteristicile) specifice celulelor tumorale

Trăsăturile celulelor tumorale- reprezintă setul de caracteristici care disting celulele canceroase de celulele sănătoase. Aceste repere au pornit de la ideea a doi oameni de știință americani foarte renumiți, numiți Doug Hanahan și Bob Weinberg. Când ei au scris pentru prima dată despre caracteristicile cancerului în anul 2000 au prezentat șase trăsături distincte; dar de atunci, au adăugat încă patru. Unii oameni de știință nu sunt complet de acord cu lista lui Bob și Doug, dar cele zece repere pe care le-au descris sunt utile pentru a ne ajuta să înțelegem de ce se comporta celulele tumorale așa cum se comportă.

Caracteristica numărul 1 - Autoreplicarea

Prima caracteristică a celulelor tumorale este autoreplicarea, adică celulele tumorale își pot controla replicarea celulară. În cadrul celulelor normale, semnalizarea celulară prin factorii de creștere este controlată strict pentru a menține homeostazia țesuturilor și a altor funcții celulare.

Celulele tumorale sunt foarte diferite și au capacitatea de a prolifera continuu, prin pierderea unor gene supresoare precum și prin supra expresia oncogenelor, precum RAS, SARK și multe altele.

Celulele tumorale au, de asemenea, capacitatea de a stimula celulele normale care le înconjoară în ceea ce se numește micromediul tumoral și de a le furniza factori de creștere esențiali.

Caracteristica numărul 2 - Replicare nelimitată

Celulele umane normale au o capacitate finită de a se divide prin mitoze ceea ce se numește problema replicării finale. Acest lucru se datorează în mare parte în parte telomerilor cromozomilor, care reprezintă regiuni de ADN repetitiv de la capetele cromozomilor și care devin mai scurte după fiecare diviziune mitotică. Unul dintre primii savanți care au observat acest lucru a fost Dr. Lenit Hayflick. Când celulele se opresc din diviziune, se știe că au atins limita lui Hayflick. Iar odată ce celulele ajung la limita lui Hayflick, nu mai pot diviza și intră în faza G0 a ciclului celular similară și senescenței celulară. În figura de mai jos capetele cromozomilor ilustrate în roz sunt telomerele.

Figura 5. Telomerele. Celulele normale nu se pot înmulți la infinit, iar capacitatea lor finită de a se înmulți se datorează telomerelor- zone de ADN la capătul fiecărui cromozom-. Telomerele devin din ce în ce mai scurte de fiecare dată când o celulă se divide. Și când telomerele unei celule devin foarte scurte, acest lucru îi spune că nu se va mai înmulți niciodată. Celulele canceroase produc totuși o enzimă numită telomerază - aceasta prelungește telomerii celulelor și le permite să se înmulțească pentru totdeauna.

În celulele normale se oprește secvența diviziunilor celulare odată ce telomerele devin prea scurte. Cu toate acestea, un semn distinctiv al celulelor tumorale este că ele sunt în măsură să depășească foarte mult limita lui Hayflick și continuă să intre în faza de mitoză. Depășirea limitei lui Hayflick se realizează prin utilizarea unei enzime denumită telomerază. Telomeraza este capabilă să alungească telomerele atunci când sunt prea scurte pentru a susține proliferarea și este supraexprimată în mai multe tipuri de cancer. Prin faptul că celulele canceroase sunt imortale, sunt capabile să prolifereze continuu și de asemenea, ele pot transmite celulelor fiice gene mutante.

Caracteristica numărul 3 - Suprimarea inhibiției de contact

Celule normale, în pecial cele epiteliale se dezvoltă și cresc pâă la anumite limite când contactul între ele și cu substratul ( o celulă endotelială de exemplu) le oprește dezvoltarea printr-un proces denumit inhibiție de contact. Ceululele tumorale și-au suprimat această trăsătură, nu mai simt contactul cu celulele înconjurătoare și se pot dezvolta invadând spațiul din jurul lor.

Urmariți linkul pentru mai multe explicații

Caracteristica numărul 4 - activarea invaziei și metastazei

Înainte de instalarea procesului metastatic, la nivelul tumorilor au loc mai multe procese:

Aceste procese sunt expuse în cele ce urmează.

În primul rând, interacțiunile celulă și celulă-matrice extracelulară sunt modificate. Modificările constau în dereglarea sau pierderea unor de proteine structurale care mențin celulele legate de matricea extracelulară, ca de exemplu integrinele și alte proteine de adeziune. Există o pierdere de gene sau mutații ale genelor care se văd în leziunile metastatice. Celule își pierd forma și polaritatea specifică.

De asemenea, apare procesul de recrutare de celule imune descris anterior, apoi se observă procesul denumit tranziția epitelial-mezenchimală (TEM). Conform figurii 6 se observă în partea stângă celule normale care sunt cuboide și staționare, conectate de matricea extracelulară prin integrine și alte molecule de adeziune. Aceste celule sunt conectate unele de altele de E-cadherin și alte proteine de interacțiune celulă-celulă.

Există o pierdere în timp a proteinelor normale, dar pe măsură ce TEM avansează a se observă achiziția unor proteine mesenchimaleAcest lucru se remarcă prin pierderea aderenței integrinelor la matricea extracelulară. Ca urmare, celulele tumorale devin mai invazive și încep să migreze în țesuturile înconjurătoare.

Figura 6. Tranziția epitelial mezemchimală

În urma TEM celulele devin mai agresive și mai mobile și pot obține proprietăți celulare care le permit să rupă matricea extracelulară protectoare. După ruperea matricei celulare, și pătrund în vasele de sânge nou formate prin angiogeneză. Acest proces prin care celulele mezemchimale pătrund în vasele sangvine se numește intravazare (figura 7). În circulația sangvină celulele mezemchimale trebuie sa reziste atacului sistemului imunitar, asa cum am descris anterior. Deși uneori o celulă tumorală circulantă sau CTC se poate opri într-un vas de sânge transversal și să nu intre în sistemul arterial, acestea ar putea dezvolta metastaze pulmonare.

Figura 7. Metastaza. Se observă ruperea matricei extracelulare, intravazarea în vasele sangvine, extravazarea și invazia organelor.

Ultimul pas cheie al metastazelor este extravazarea. Acestea reprezintă procesul de ieșire din sistemul sangvin și limfatic și de stabilire a unor situsuri secundare ale tumorii într-un organ îndepărtat. Odată ce o celulă tumorală poate începe să crească o tumoare metastatică într-un sit secundar, această tumoare urmează multe dintre aceleași caracteristici distinctive ca tumorile anterioare, cum ar fi imortalitatea replicativă, rezistența la apotoză, evitarea supravegherii imune, modificarea metabolismului, precum și alte caracteristici celulare. Cu cât este mai mare tumora secundară, cu atat mai multe probleme poate provoca.

Caracteristica numărul 5 - Inducerea angiogenezei

Angiogeneza este procesul prin care celulele tumorale își formează propriul sistem sangvin. Acest proces se desfășoara în cursul dezvoltării embrionare, în timpul vindecării rănilor (atunci circulația sanguină este restaurată la țesuturile afectate). Angiogeneza este observată și în cadrul unor boli dependente de inflamație și angiogeneză. În cancer, angiogeneza tumorală reprezintă proliferarea unei noi rețele de vase de sânge care străbate masa canceroasă, asigurând necesarul de oxigen, favorizând creșterea tumorii. În lipsa vascularizării, tumorile nu pot crește mult peste mărimea unui ac cu gămălie. Formarea noilor vase capilare are loc ca răspuns la un apel chemotactic puternic. Unele dintre cele mai stabile celule din organism sunt celulele endoteliale. Acestea au un timp de reînoire de aproximativ 1000 zile. Perioada aceasta este redusă la minim 5 zile în timpul declanșării angiogenezei.

În 1971, Dr. Judah Folkman a emis ipoteza că angiogeneza este procesul care permite creșterea tumorală în cancer. Acesta a introdus conceptul că tumorile secretă molecule care pot stimula creșterea unor noi vase de sânge, având astfel ca rezultat neovascularizarea tumorii. Inițial această ipoteză a fost respinsă de oamenii de știință, dar mai apoi ideile lui Folkman au fost acceptate și au pus bazele dezvoltării terapiilor care utilizează inhibitori, în tratamentul cancerului.

La începutul anilor 80, industria biofarmaceutică a început să exploateze acest proces, angiogeneza, pentru a creea noi compuși terapeutici pentru modularea formării de noi vase de sânge în creșterea tumorală.

În 1989, Dr. Napolene Ferra a făcut o descoperire remarcantă atunci când, împreună cu echipa sa, au identificat și au izolat VEGF (factorul de creștere endotelial vascular). Acest factor joacă un rol crucial în vascularizare.

Un alt eveniment important în istoria terapiilor angiogenetice a fost reprezentat aprobarea de către FDA (Food and Drug Administration) a primului inhibitor angiogenetic, și anume Avastin (Bezacizumab). Avastin este un anticorp monoclonal umanizat anti-VEGF.

Caracteristica numărul 6 - Rezistența la apoptoză

Celulele normale își pot iniția propia moarte, cunoscută și sub numele de apoptoză ca răspuns la mutații sau alte deteriorări ale ADN-ului, sau în urma unor condiții care induc stres celular determinate de factori externi. Așa cum indică și prima caracteristică celulele tumorale au capacitatea de a supra-regla proteinele pro-supraviețuire care determină evitarea apoptozei atunci când stresul celular ar declanș-o. Un exemplu de proteină implicată supraviețuire care a fost văzută supraexprimată în multe tipuri de cancer este proteina de supraviețuire Bcl-2. Bcl-2 aparține familiei de proteine anti-apoptotice, cum ar fi Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, CED-9, A1, Bfl-1 și de asemenea membrii familiei pro-apoptotice cum ar fi Bax, Bak, Bcl-Xs, Bim și altele.

În multe tipuri de cancer, Bcl-XL și Membrii familiei Bcl-2 se exprimă preferențial.

Caracteristica numărul 7 - Metabolism alterat

Metabolismul alterat al celulelor tumorale este explicat printr-un proces denumit efect Warburg.

Re-programarea energiei metabolice a fost identificată ca o amprentă emergentă în celulele tumorale. Pentru ca acestea să susțină proliferarea necontrolată, ele trebuie să-și adapteze producția de energie. Celulele tumorale fac acest lucru prin găsirea și utilizarea surselor alternative și căi alternative metabolice. Celulele normale descompun în mod obișnuit glucoza într-un proces numit glicoliză și o transformă în piruvat, care asigură adenozin trifosfat, sau ATP, pentru celulă. Acest lucru se face în mare parte în mitocondrii. Acest proces are loc in prezența O2 (aerob). În condiții hipoxice, piruvatul poate fi transformat în lactat care este apoi transportat în ficat unde este convertit in glucoză. Cu toate acestea, celulele canceroase sunt foarte diferite, unde pot converti glucoza la lactat indiferent de cantitatea de oxigen disponibilă. Cercetarea în domeniul cancerului molecular relevă, de asemenea, o serie de mutații de activare a unor enzime care ajută la exacerbarea acestui proces. Acest lucru permite celulelor tumorale să devieze metaboliții către procesele anabolice utile, cum ar fi mitoza.

Iată o privire asupra metabolismului celulelor tumorale alături de un metabolism normal al celulelor (caseta 3). În timp ce o celulă normala utilizează glocoza din circulația sangvină pe care o convertește prin glicoliză până la piruvat și mitocondriile prin ciclul Krebs pirn care produce 36 de molecule ATP. Celula tumorală necesită o cantitate mai mare de glucoză pe care o va transforma în două molecule de ATP.

Caracteristica numărul 8 - Evitarea sistemului imunitar 

Sistemul imunitar este o reţea complexă de celule, ţesuturi şi organe, cu rol de apărare a organismului împotriva agresiunilor de orice natură, fiind supus continuu influenţei mediului extern. Termenul de imun îşi are originea în limba latină, unde ,,imunis” înseamnă liber, curat. Sistemul imun devine din ce în ce mai complex în evoluţie, cel mai dezvoltat fiind la mamifere. El distruge atât corpii străini (antigene non-self), cât şi structuri proprii alterate, îmbătrânite sau tumorale, contribuind astfel la menţinerea stării de sanatate a organismului. Pașii exacți implicați în generarea unui răspuns imun sunt ușor diferiți în funcție de tipul de amenințare (virus, bacterii etc.), dar în general celulele noastre recunosc mici părți ale țintei, de obicei fragmente de proteine care sunt create prin digestia a unei proteine mai mari. De exemplu, o bacterie care invadează pielea printr-o rană poate fi recunoscută de proteinele de pe suprafața acesteia. O proteină sau un alt produs (zahăr, lipid etc.) care poate fi recunoscut de sistemul imunitar și care conduce la producerea unui răspuns imun este cunoscut ca un antigen. Unele celule imune, inclusiv macrofagele și celulele dendritice, pot transporta aceste proteine pe suprafața lor, ca și cum ar flutura un steag! Fragmentele de proteine (antigene) sunt "prezentate" celulelor B și T și determină ca aceste celule să devină active. Celulele care sunt capabile să prezinte antigeni sunt cunoscute, suficient de clar, ca Antigen prezentând celule sau APC.

Caseta nr. 3 - Efectul Warburg Influenţa pe care mitocondria o are în sănătatea umană este un subiect tot mai studiat ca urmare a rolului important pe care îl are în supravieţuirea şi în moartea celulară. Primele alterări şi disfuncţii mitocondriale în cancer au fost observate în anul 1920 prin descoperirea efectului Warburg. Cu mai mult de 80 de ani în urmă, biochimistul Otto Warburg a descris procesul prin care celulele canceroase consumă glucoză şi produc acid lactic în condiţii anaerobe. Studii recente referitoare la efectul Warburg atestă implicarea acestuia în procesul de carcinogeneză. Warburg a sugerat faptul că disfuncţiile mitocondriale contribuie la dezvoltarea tumorilor. S-a demonstrat faptul că mutaţiile care afectează ADN-ul mitocondrial şi enzimele implicate în ciclul acizilor tricarboxilici contribuie la efectul Warburg. Mutaţiile ADN-ului mitocondrial care sunt cel mai des întâlnite în cancerele umane pot duce la codificarea unor componente ale catenei respiratorii nefuncţionale. În efectul Warburg sunt implicate de asemenea şi câteva oncogene precum AKT care codifică o serin-treonin-kinază. Această genă este asociată cu preluarea glucozei şi cu glicoliza aerobică independentă de HIF-1 (hypoxia inductible-factor 1). AKT mobilizează transportorii de glucoză la suprafaţa celulară pentru a spori absorbţia glucozei şi activează hexokinaza 2 care fosforilează şi captează glucoza intracelulară. Prin aceste efecte, AKT ameliorează fluxul glicolitic fără a afecta fosorilarea oxidativă de la nivelul mitocondriei contribuind astfel la efectul Warburg. Oncogena MYC (genă reglatoare care codifică un factor de transcripţie; proteina codificată de această genă este o fosfoproteină multiuncţională cu rol în ciclul celular), este deseori actvată în cancer şi este implicată în activarea glicolizei aerobice. Factorul de transcriere Myc activează genele codificatoare pentru enzimele glicolitice inclusiv pe cele care codifică hexokinaza 2, enolaza şi LDH-A (lactat dehidrogenaza A). În fibroblaste de şobolan Myc este capabilă să realizeze glicoliza oxidativă, cu toate că în celula umană activarea Myc a dus la creşterea respiraţiei celulare şi la biogeneză mitocondrială. Activarea Myc duce la creşterea concentraţiei unor specii de oxigen reactive responsabile cu mutaţiile ADN-ului mitocondrial care duc ulterior la alterarea funcţiilor mitocondriale. Supresorul tumoral p53 care suferă mutaţii în mod frecvent în cancerele umane stimulează respiraţia mitocondrială prin transactivarea genei SCO2 pentru sinteza citocrom c oxidazei 2. SCO2 este necesară pentru a asambla subunitatea MTCO2 la complexul citocrom c oxidazic, care este parte a catenei respiratorii. Ameliorarea exprimării p53 sau SCO2 prin trecerea de la respiraţie celulară la glicoliză aerobică, denotă faptul că inactivarea p53 este implicată în efectul Warburg. De cele mai multe ori în cazul celulelor tumorale, căile metabolice sunt modificate. Această schimbare creează un mediu acid în jurul tumorii, mediu prielnic pentru desfăşurarea procesului de carcinogeneză. Ca şi consecinţă a acidităţii tumorii, micromediul tumorii încurajază o selecţie a unor fenotipuri de celule capabile să supravieţuiască în mediul acid în detrimentul altor tipuri celulare. Selecţia poate fi definită printr-un proces în care celula tumorală îşi creează un mediu neprielnic prin creşterea acidităţii prin aceasta reducând însă şi posibilitatea de proliferare pentru restul celulelor.

Figura 8. Interacțiunea celulelor tumorale cu sistemul imunitar. Celulele din sistemul imunitar ne protejează de cancer prin recunoașterea și distrugerea celulelor defecte. Pentru a supraviețui: celulele canceroase se ascund de globulele albe prin eliminarea proteinelor defecte de pe suprafața lor. Și, suprimă globulele albe din sânge care încearcă să le distrugă.

Termenul de „glonţ magic” utilizat în terapia cancerului a fost introdus de Paul Ehrlich la sfârşitul secolului XIX ca o referire la anticorpii care anihilează atât microorganismele cât şi celulele tumorale. Teoria supravegherii imune a tumorilor, enunţată iniţial de Ehrlich, apoi reluată de Burnett şi Thomas recunoaşte rolul major în controlul apariţiei şi proliferării tumorilor. Această teorie ar putea explica creşterea frecvenţei tumorilor, paralel cu diminuarea eficacităţii apărării imune odata cu vârsta.

Odată cu noile modele experimentale şi creşterea volumului cunoştinţelor de genetică, au fost obţinute modele experimentale, care indica că atât rezistenţa naturală cât şi cea adaptativă au rol în controlul dezvoltării şi progresiei tumorale. Interacţiunea dintre tumoră şi organismul-gazdă implică sistemul imun la niveluri variate.

Terapiei imuna a cancerului se bazează pe faptul că tumora exprimă un profil antigenic distinct de celula normală şi, astfel, sistemul imun este capabil să recunoască aceste diferenţe antigenice .

Celulele tumorale diferă de celulele normale, atât prin compoziţia antigenică, cât şi prin comportamentul biologic. Instabilitatea genetică survenită în urma mutaţiilor în ADN, este una din „emblemele” fenotipului malign şi determină apariţia de antigene tumoral-specifice (TSA), întâlnite doar pe celula tumorală. TSA fac parte din clasa de antigene asociate tumorilor (TAA). TAA, normal se regăsesc în celula normală în numar foarte redus. TAA devin periculoase când expresia lor este foarte crescută în celula normală şi sunt molecule asociate unei mari varietăţi de cancere (proteina Ras, p53). TAA şi TSA sunt folosite în imunoterapia cancerului, ca ţinte (anticorpi monoclonali).

Bazele moleculare ale recunoaşterii celulelor tumorale de sistemul imun în imunitatea adaptativă (umorală şi celulară)

Antigenele TSA sunt prezentate celulelor imune de celulele prezentatoare de antigene (APC), adică celule dendritice şi macrofage şi sunt recunoscute de receptori de pe limfocite (Ig imature în cazul limfocitelor B, sau TCR-T cell receptors, pentru limfocitele T). Limfocitele Th exprimă pe suprafaţa lor antigene, dar şi receptori pentru antigene (TCR), care recunosc şi se leagă de TSA de pe celula tumorală. În urma acestei interacţiuni, are loc activarea limfocitelor Tc, care vor secreta enzime şi citokine. Aceste molecule citotoxice distrug celulele tumorale. Limfocitele B sunt activate de contactul lor cu antigenul tumoral, şi prin intermediul Th, ele se transformă în plasmocite secretoare de anticorpi, care sunt efectori majori în rejectarea celulelor tumorale, în special Ig M.

Cu toate acestea, celulele tumorale sunt capabile să se protejeze de atacuri din celulele T și alte tipuri de celule prin reglarea unei proteine. Foarte bine studiate în biologia cancerului sunt proteinele tumorale transmembranare PDL1 respectiv PDL2. Aceste proteine joacă un rol major în suprimarea sistemului imunitar în timpul evenimentelor particulare cum ar fi sarcina, alografiile de țesut, boli autoimune și alte stări de exemplu hepatita. Celulele T exprimă PD-1 și iar interacțiunea cu PDL1 servește ca un punct de control pentru a determina celulele T să oprească proliferarea. Ca urmare, procesele implicae în autoimunitate sunt stopate. Celulele tumorale reglează PDL1, interacționează cu PD-1, astfel încât celulele T nu le pot ataca. Acesta este un mod foarte important în modul în care celulele tumorale sunt capabile să se sustragă sistemului imunitar. Există studii în curs de desfășurare și medicamente aprobate de FDA care antagonizează PD-1, astfel încât celulele T pot ataca celulele tumorale.

Caracteristica numărul 9 - Instabilitatea genomului

Celulele eucariote normale au în nucleu 22 autozomi și o pereche de cromozomi sexuali. Dacă o celulă normală supusă sintezei ADN în timpul ciclului celular detectează o mutație care apare în fazele gap-ului ciclului celular este capabilă să oprească ciclul celular, să repare mutația apoi reintră ciclul celular. Genele implicate în stoparea ciclului celular când sunt detectate mutații sunt cunoscute sub numele de gene supresoare tumorale și au fost discutate în capitolul 1.

Celulele tumorale diferă de celulele normale printr- o cantitate anormală de cromozomi în nucleu și de asemenea, prin posibilitatea de a fi supuse mitozei continuu. Genele care sunt mutate sau s-au pierdut în procesul de tumorigeneză contribuie la instabilitatea genomului. Prin tehnica de biologie moleculară numită cariotipare, care este o metodă de evaluare a numărului de cromozomi din nucleu se analizează cariotipul unui pacient cu leucemia mieloidă cronică (LMC), și se observă o deleție în cromozomul numărul 22. Celulele normale vor elima astfel de mutații și vor continua să se dividă. Celulele tumorale sunt capabile să se dividă în mod continuu și să perpetueze aceste mutații.

Această instabilitate genomică ne conduce la a treia caracterstică: evitarea semnalelor de suprimare a creșterii.

Caracteristica numărul 10 - Stimularea proceselor inflamatorii

Următoarea caracteristică implică tot sistemul imunitar și acest lucru este cunoscut sub numele de inflamație care promovează tumori. Inflamația stimulează creșterea tumorii și migrația celulelor tumorale și în final metastaza. Micro-mediul tumoral este adesea infiltrat cu celule imunitare adoptive care permit tumorilor să imite condițiile inflamatorii care sunt observate în țesuturile normale. Cercetările moleculare curente privind cancerul indică faptul că aceast proces asociat tumorii poate ajuta la creșterea ei. În plus, inflamația este văzută în primele etape ale tratamentului în mai multe boli neoplazice. Inflamația precoce poate elibera sumolecule specifice în micromediul tumoral care pot determina mutații și pot permite celulelor să accelereze formarea de tumori. La fel ca și celulele care trec prin procesul denumit tranziție epitelial-mezemchimală (TEM), celulele tumorale secretă citokine și chemokine care reglează proliferarea celulelor imune și acumularea lor. Aceste celule secretă, de asemenea, proteaze, care sunt enzime degradante cu rol de descompunere a unor proteine, în special cele găsite în matrixul extracelular. La rândul lor, celulele imune pot secreta acești factori înapoi către celulele tumorale ceea ce stumulează motilitatea celulară, supraviețuirea celulară și angiogeneza Toate acestea permit celulelor tumorale să crească, să supraviețuiască și să invadeze.

 Comunicarea celulară

În continuare vom discuta despre mediul în care celulele tumorale trăiesc și despre ce alte celule trăiesc alături de ele. Celulele tumorale evoluează până la momentul când o persoană este diagnosticată cu cancer, tumora conține deja multe populații diferite de celule și fiecare populație are o combinație unică de mutații în interiorul lor. În plus, celulele canceroase dintr-o tumoră nu trăiesc singure. De fapt, tumorile conțin multe diferite tipuri de celule și celulele canceroase sunt adesea depășite de alte tipuri de celule.

În primul rând, când oamenii de știință vorbesc despre celulele non-canceroase care trăiesc în tumori, ei se referă la ele ca „celule stromale”. Tipul, numărul și varietatea de celule stromale dintr-o tumoră variază de la cancer la cancer și de la pacient la pacient. Celulele stromale includ în mod obișnuit celule structurale denumite fibroblaste, leucocite, celule musculare netede, celule epiteliale și celule din țesutul adipos, care sunt cunoscute sub numele de adipocite. Tumorile conțin și vase de sânge sau vase limfatice. Vasele de sânge care există în tumoră sunt esențiale pentru supraviețuirea celulelor canceroase, pentru că aduc un aport de oxigen și nutrienți. Unele dintre celulele stromale ale tumorii vor fi fost în țesut înainte de a crește tumora; altele (ca. multe leucocite) vor fi fost atrase mai târziu de tumoră.

Conviețuirea dintre celulele canceroase, vasele de sânge și alte celule din micromediul tumoral poate avea un impact enorm asupra funcționării unui tratament. În figura 9 este ilustrat micromediul cancerului pancreatic - posibil cel mai dificil cancer de tratat.

Figura 9. Micromediul tumoral în cancerul pancreatic

Cancerele pancreatice conțin o cantitate uriașă de proteine fibroase, creând un fenomen cunoscut sub numele de desmoplazie. Desmoplazia acționează ca o barieră fizică care împiedică medicamentele pentru cancer să ajungă acolo unde sunt necesare. Celulele tumorale sunt, de asemenea, protejate de milioane de leucocite care suprimă imunitatea. Mai mult, celulele tumorale se pot inghesui pe lângă fibrele nervoase, unde medicamentele nu le pot ajunge. Împreună, desmoplazia, leucocite, și capacitatea celulelor canceroase de a se răspândi prin nervi face cancerul pancreatic ezistent la majoritatea tratamentelor.

Multe dintre noile tratamente țintite pentru tumorile solide blochează proteinele implicate în comunicarea celulară. Pentru a înțelege cum funcționează aceste tratamente, este important să înțelegem mai întâi cum și de ce celulele noastre comunică și cum s-a schimbat acest lucru în celulele tumorale. Pe baza acestor informații, medicamentele care țintesc proteinele de comunicare a celulelor țintă ar trebui să aibă sens. Primul lucru pe care trebuie să îl înțelegem este că toate celulele noastre comunică una cu alta tot timpul. Schimbă mesaje de genul: sunt fericită; ai greșit; rămânem fără oxigen; ne aglomerăm; cred că ar trebui să rămâi în viață; cred că ar trebui să mori. Mesajele „Sunt fericit” și ”ar trebui să rămână în viață” sunt adesea transmise de factori de creștere. Semnalizarea factorilor de creștere este deseori eronată în celulele canceroase și, întrucât este ținta multor tratamente noi, merită să vorbim ceva mai mult despre aceasta. Factorii de creștere sunt proteine mici eliberate de celule în vecinătatea lor. Ei parcurg distanțe scurte înainte de a se conecta la receptorii factorilor de creștere care sunt exprimați pe suprafața celulelor vecine. Dacă semnalul este mai puternic, probabil datorită prezenței multor factori de creștere, atunci acest lucru îi spune celulei să facă câteva proteine în plus care o determină să se înmulțească. Și dacă semnalul merge cumva greșit, atunci celula scapă de sub control și începe comportându-se ca o celulă canceroasă. Când factorii de creștere se atașează și se conectează la receptori, se declanșează o reacție în lanț în interiorul celulei. Reacția în lanț, cunoscută sub numele de cale de semnalizare, determină celula să producă o varietate de proteine care adesea doar o țin în viață în viață.

Figura 10. Prezentarea schematică a unei căi de semnalizare în care este implicată proteina Rb

În imagine este o cale de semnalizare care duce la activarea proteinei Rb situate in nucleu de către factorul de transcriere E2F si care determină progresia ciclului celular.

În scopul înțelegerii tratamentelor împotriva cancerului, în imagine este descrisă o altă cale- și aceasta este calea PI3K / AKT / mTOR. Medicamentele care blochează mTOR sunt tratamente autorizate pentru câteva tipuri de cancer în aceste zile, inclusiv cancer renal și cancer de sân. Ca și calea MAP kinazei, calea PI3K / ATK / mTOR este activată de perechea receptori - factor de creștere. Ambele căi sunt ilustrate foarte simplu aici. După cum puteți vedea, există o proteină numite PTEN, o proteină naturală în celulele noastre care blochează Calea PI3K / AKT / mTOR. PTEN lipsește adesea din celulele canceroase. Veți vedea că există, de asemenea, o mulțime de săgeți punctate răspândite din AKT și mTOR, deoarece aceste proteine ambele fac o varietate de lucruri diferite celulele noastre, inclusiv dacă au greșit, spunând unei celule să crească necontrolat.

Figura 11. Căi de semnalizare țintite de tratamente

Această ilustrare arată unele dintre cele mai frecvente mutații întâlnite în celulele tumorale solide. Cu toate acestea, mulți alți receptori ai factorilor de creștere și căi de semnalizare sunt implicați într-o mare varietate de tumori solide.

Urmăriți videoclipul în care se discută despre comunicarea celulară https://www.babraham.ac.uk/blog/how-do-cells-communicate

Aceste căi sunt de asemenea supra-active în cancerele de sânge. În următoarea secțiune, vom analiza câteva tratamente care vizează proteinele prezentate în ilustrație. Aceste tratamente se încadrează în două grupe principale: anticorpi monoclonali și inhibitori de kinaze.

Anticorpi monoclonali

Vom reveni la tratamentele care vizează receptorii factorilor de creștere și proteinele pe care le controlează pe căile de semnalizare. Aceste tratamentele se încadrează în două grupe principale: anticorpii monoclonali și inhibitorii kinazici. Scopul anticorpilor monoclonali este de a bloca proteine pe suprafața celulelor canceroase. Inhibitorii kinazici trebuie să intre în mediul intracelular pentru a bloca proteinele din citoplasmă și nucleu. Mai întâi vom vorbi despre anticorpi monoclonali.

Acestea se bazează pe structura anticorpilor găsiți în mod natural în sângele nostru, care ne ajută să combatem infecții precum bacterii, virusuri și paraziți.

Figura 12. Structura unui anticorp

O caracteristică importantă a anticorpilor este regiunea lor variabilă, aceasta este partea unui anticorp care îi permite să se lege foarte strâns și foarte precis de ținta sa. Anticorpii au, de asemenea, un regiune constantă prin care atrag leucocitele din sânge pentru a lupta împotriva infecției. În ultimii 40 de ani, oamenii de știință au reușit sa creeze anticorpi care se atașează de proteine găsite pe suprafața celulelor canceroase (Figura 12).

În ultimii 40 de ani, oamenii de știință au ajuns foarte bine la crearea anticorpilor care se atașează de proteine găsite pe suprafața celulelor canceroase. Știm că acești anticorpi pot ucide imediat unele celule canceroase și își păstrează și capacitatea de a atrage celule albe.

De exemplu, un tratament cu anticorp numit cetuximab (numit și Erbitux) este uneori administrat persoanelor cu cancer de intestin. Majoritatea celulelor canceroase intestinale au o mulțime de receptori EGF pe suprafața lor. Acești receptori activează continuu căile de semnalizare (cum ar fi calea MAPK) și care obligă celulele să se înmulțească.

Figura 13. Efectul Cetuximab asupra celulelor tumorale

Când pacientului i se administrează Cetuximab, aceasta se conectează la Receptorii EGF, iar receptorii EGF nu mai pot dimeriza. Și dacă nu se pot combina, receptorii EGF nu se pot activa căi de semnaliza, iarcelula nu numai că nu mai divide, ci moare. Cetuximab pare, de asemenea, să spună celulei să elimine receptorii EGF de pe suprafața sa și să-i distrugă.

Dacă Cetuximab nu ucide celula în mod clar, atunci există încă șansa ca acesta să omoare celula prin intermediul sistemului imunitar. Prin regiunea sa constantă anticorpul atrage celule din sistemul imunitar. Unele dintre celulele albe din sânge - precum macrofagele și celulele Natural Killer au receptorii numiți Receptori Fc pe suprafața lor. Și prin receptorii Fc lor pot interacționa cu anticorpii cum ar fi cetuximab. Odată ce macrofagele s-a atașat de cetuximab, aceasta îi dă semnalul de a distruge celula tumorală, proces numit CCDA sau citotoxicitate celulară dependentă de anticorp.

Cu toate acestea, capacitatea celulelor imunitare pentru a face acest lucru va depinde de ce tipuri de leucocite există în tumoră și de capacitatea lor de atac. Alți anticorpi proiectați să se atașeze receptorilor EGF - cum ar fi panitumumab, numit Vectibix și necitumumab, numit și Portrazza, se crede că funcționează în același mod, la fel ca anticorpii proiectați pentru a se atașa la alte proteine de suprafață celulară, cum ar fi HER2 sau CD20.

Pentru unii oameni, un tratament cu anticorpi nu funcționează deloc, pentru alții, nu mai funcționează după un timp. Unul dintre motivele acestui lucru se întoarce la ceva despre care am menționat secțiunea anterioară - dacă există un defect al unei proteine de semnalizare din interiorul celulei, atunci receptorul de pe suprafața celulei devine nefunctional. Și aceasta se întâmplă uneori în celulele tumorale care nu sunt distruse de tratamente cu anticorpi - au defecte suplimentare în interiorul acestora, care fac ca receptorii de pe suprafața celulei să fie redundanți, etc. blocarea lor devine ineficientă.

Un alt lucru de remarcat despre Cetuximab este x în mijlocul numelui. Aceasta vă spune că anticorpul este himeric - o parte a structurii proteice a anticorpului provine de la un anticorp realizat de un șoarece. Faptul că există anticorpi de șoarece în anticorpii pe care îi utilizăm ca tratamente pentru cancer provine din modul în care a fost făcut, care este adesea prin injectarea de proteine de pe suprafața celulelor canceroase umane corpul unui șoarece. Mulți anticorpi mai noi conțin mai puține proteine de șoarece, sau deloc.

Figura 14. Tipuri de anticorpi monoclonali

Amplificarea genei Her2 determină supra-producția de Her2 și exacerbarea căii de semnalizare MAP-kinaza.

Când o femeie este diagnosticată cu un cancer de sân „ Her2 pozitiv”, adică cu amplificare genică Her2, acesta este un semn că cancerul va fi foarte agresiv și dificil de tratat. Cu toate acestea, acum avem o varietate de tratamente țintite Her2, incluzând trei anticorpi (trastuzumab, pertuzumab și trastuzumab-emtansine) și un inhibitor al kinazei (lapatinib). Trastuzumab (Herceptin) a fost autorizat ca tratament pentru cancerul de sân HER2 pozitiv în Europa în 2000, iar această licență a fost extinsă pentru a include cancerul de stomac HER2 pozitiv în 2010. Pertuzumab (Perjeta), trastuzumab-emtansine (Kadcyla) și lapatinib (Tyverb) sunt, de asemenea, autorizați pentru a trata cancerul de sân.

Figura 15. Terapii țintite anti Her2

Mecanismul de acțiune al lui Trastuzumab nu este încă 100% clar, dar există o mulțime de dovezi ca împiedică Her2 să activeze căile de semnalizare și, dacă există leucocite la locul tumorii, ar trebui să le poată atrage și activa.

Pertuzumab funcționează împiedicând dimerizarea Her2 cu alți membri ai familiei Her - dacă Her2 nu poate dimeriza, nu poate activa semnalizarea.

Lapatinib, ca și alți inhibitori kinazici, blochează partea kinazică Her2 care se află în interiorul celulei.

In cele ce urmează vom discuta despre Inhibitori de tirozin kinaze.

Caseta numărul 3 - HER2                                                                                                        HER2 (receptorul uman de creștere epidermică H = receptorul factorului de creștere epidermal uman) este o oncoproteină codificată de gena HER2 pe cromozomul 17. Mai mult, HER2 este un marker tumoral, deoarece este supraexprimat în 25-30% din cazurile de cancer mamar și face parte din familia receptorilor transmembranari tirozină-kinază din familia EGFR (receptorul factorului de creștere epidermial), numit EGFR familia care constă din 4 membri: 1.    HER1, cu liganzi specifici: EGF, TGF, AMFIREGULINĂ, HB-EGF, EPIREGULINĂ, BETA-CELULLINĂ 2.    HER2 – NU ARE LIGANZI 3.    HER3, cu ligandul specific: HEREGULIN 4.    HER4, cu liganzi specifici: NRG2, NRG3, HEREGULIN, BETA-CELULLIN Caracteristicile generale ale acestor receptori sunt: Din punct de vedere structural sunt alcatuite din 3 zone: 5.    Domeniu extracelular 6.    Domeniul transmembranar 7.    Domeniul intracelular HER2 formează homodimeri (HER2-HER2) sau heterodimeri (HER2-HER1/HER3/HER4). Împreună cu factorii de creștere care îi stimulează, joacă un rol important în creșterea celulară și diviziunea celulară (transmiterea semnalelor din afara celulei către nucleu). Căile de semnalizare prin care exercită aceste efecte sunt Calea Pi3K- PDK- AKT: este activată atunci când HER2 formează homodimeri (HER2-HER2) și apare după cum urmează: Activează fosfoinositida 3-kinaza (PI3K) Pentru a transmite semnalul PI3K utilizează PIP2 (componenta fosfolipidică a membranelor celulare), pe care o transformă prin fosforilare în fosfatidilinozitol trifosfat (PIP3), care activează kinaza dependentă de pdk 1.  Fosforilează kinază dependentă de fosfoinozită (PDK) AKT, care inhibă factorii de transcriere, ducând la supraviețuirea celuleloCalea Ras-Raf-MAPK: se activează atunci când HER2 formează heterodimeri (EGFR / HER1-HER2). Această cale este un mediator important al proliferării celulare și al angiogenezei.

Inhibitori de tirozin kinaze

Din grupul terapiilor țintite o categorie importantă sunt inhibitorii de kinaze.

Sunt acum aproximativ treizeci de inhibitori de kinaze licențiati în Europa și SUA ca tratamente pentru cancer. Douăzeci sau mai mulți dintre ei sunt folosiți pentru a trata tumori solide cum sunt: cancerul de piele de tip melanom, cancer pulmonar, cancer de sân și rinichi. Cum am vorbit în ultimul curs și tratamentele cu anticorpi, cum ar fi necitumumab, trastuzumab și bevacizumab sunt utilizate pentru a trata aceleași tipuri de cancer. Suprapunerea se datorează faptului că ambele grupuri de tratamente pot fi folosite pentru a bloca receptorii factorilor de creștere Receptori EGF, receptori HER2 și VEGF. Cu toate acestea, în loc să se atașeze de acești receptori din afara celulei ca un anticorp, inhibitorii kinazici pot intra în celulă și îi blochează din interiorul citoplasmei.

Pentru a înțelege modul în care inhibitorii kinazelor fac acest lucru, trebuie să știm un pic mai multe despre modul în care receptorii factorilor de creștere acționează. Receptorii factorilor de creștere au trei domenii principale. Există domeniul extracelular, care interacționează specific cu factorii de creștere și face ca receptorii să dimerizeze. Apoi există un domeniu care traversează membrana celulară. Și în sfârșit există domeniul kinazei. Atunci când receptorii factorilor de creștere dimerizează, acele domenii kinazice devin active și atașează fosfați unul altuia. Cănd grupările fosfat sunt adăugate se activează căile de semnalizare. Receptorii pot doar sa se autofosforileze dacă au acces la o moleculă ATP. ATP este adenozin trifosfat și acesta este sursa lor de fosfat. Și ATP seadaugă într-un loc dedocare, în partea kinazică a receptorului. Majoritatea inhibitorilor de kinaze acționează prin imitarea formei ATP și intrarea în locul de docare a kinazei. Medicamentul, fie concurează cu ATP pentru locul său de docare dacă este un inhibitor de kinaze reversibil, fie se leagă chimic de situsul de docare, dacă este un inhibitor de kinaze ireversibil. Nu doar receptorii factorilor de creștere au situsuri de docare pentru ATP, este vorba de toate kinazele. Kinază este numele dat oricărei proteine care poate atașa fosfat la alte proteine. Sunt multe kinaze implicate în căile de semnalizare MAPK și PI3Kinaza. De asemenea, unele dintre proteinele de fuziune create ca un rezultat al translocărilor cromozomiale, sunt kinaze.

Figura 16 Structura receptorilor factorilor de creștere

În teorie, toate kinazele pot fi blocate cu medicamente care imită forma ATP. Unii dintre cei mai folosiți inhibitori ai kinazei sunt gefitinib, erlotinib și afatinib, care blochează receptorul EGF.

Acest receptor este, de asemenea, ținta cetuximabului și panitumumab.

După ce au efectuat numeroase studii clinice care au implicat aproximativ 100 de pacienți cu cancer, cercetătorii au descoperit că inhibitorii kinazei funcționează cel mai bine atunci când receptorul EGF este mutat și supra-activ.

În cancerul pulmonar unde vedem aceste mutații, prin urmare, gefitinib, erlotinib și afatinib sunt date doar persoanelor cu cancer pulmonar.

Figura 17. Efectele inhibitorilor de tirozin kinaze asupra receptorului EGFR

 Anticorpii monoclonali care vizează receptorul EGF funcționează cel mai bine împotriva celulelor canceroase care au cantități excesive de receptor normal, fără mutații, cunoscut și ca receptor de tip sălbatic. Mai mult, aceste două seturi de tratamente, anticorpii monoclonali și inhibitorii ai kinazelor, de asemenea, încetează să lucreze din diferite motive. Când cetuximab și panitumumab încetează să funcționeze, se datorează celulelor tumorale cu mutații care afectează proteine precum K-Ras, B-Raf sau calea PI3K sau celulele au receptorii, precum MEK sau HER3 pe suprafața lor. Când inhibitorii kinazei încetează să funcționeze, cel mai adesea se datorează faptului că situsul de legare ATP al receptorului și-a schimbat forma. Celulele cu aceasta formă de modificare a receptorului pot supraviețui tuturor celor trei medicamente. Dar oamenii de știință au creat recent un al patrulea medicament numit osimertinib, care poate bloca receptorii EGF chiar și atunci când au și-au schimbat forma și celelalte medicamente nu vor funcționa.

Pe lângă faptul că sunt folosiți pentru cancerul pulmonar, inhibitorii de kinaze au devenit tratamente importante pentru cancerul de piele de tipul melanomului malign. Medicamentele dabrafenib și vemurafenib blochează kinaza B-Raf. Și trametinib și cobimetinib, care blochează o kinază diferită numită MEK. Acestea doua kinaze fac parte din calea de semnalizare MAPK-kinaza. Crearea vemurafenib și dabrafenib s-a datorat descoperirii în anul 2002, a faptului că o mare parte din cancerele de piele de tipul melanomului conțin o versiune defectuoasă, supra-activă a proteinei B-Raf. Aceste medicamente sunt capabile să blocheze proteina B-Raf defectă care se găsește în celulele tumorale, dar nu proteinele Raf normale găsite în celule sănătoase.

Din păcate, inhibitorii B-Raf utilizați singuri tind să nu funcționeze foarte mult timp. În câteva luni, cancerul apare din nou. Și, din cauza unui mod ciudat de acțiune, acești inhibitorii B-Raf funcționează, dar aproximativ 20% dintre pacienți cărora li se administrează un singur inhibitor B-Raf, dezvoltă cancere de piele secundare. Cu toate acestea, rezistența poate fi întârziată și se pot evita cancerele secundare ale pielii, dacă pacientului i se oferă și inhibitor MEK. Ca urmare, în Anglia a fost aprobat acum o combinație de inhibitor de B-Raf plus inhibitor de MEK pentru persoanele cu melanom malign. 

Caseta numărul 4 – Terapii hormonale în cancerul de sân Estrogenii reprezinta o familie de molecule care stimulează dezvoltarea caracterelor sexuale secundare și reproducerea la femei. Estrogenii naturali produsi sunt molecule steroid care conțin 4 inele carboxi. La premenopauza producerea estrogenilor se realizează de către ovare care se află sub controlul glandei pituitare si foarte puțin rezulta din organele periferice. La menopauza însă cantitatea foarte mică de estrogeni rezultă din aromatizarea androgenilor ovarieni sau din suprarenale în țesuturile extragonadale ca ficat, mușchi si țesut osos. Estrogenii sunt hormoni, ceea ce înseamnă că funcționează ca mesageri secundari în semnalizarea endocrină. Ei sunt transportați prin circulația sangvină și interactionează cu celule din diferite țesuturi țintă. Principalele ținte ale estrogenilor sunt sânii și uterul. Dar ei acționează și asupra creierului, oaselor, ficatului și inimii. Din pacate estrogenii au și efecte negative tocmai datoritș faptului că stimulează proliferarea celulelor din sân și uter. În anumite țesuturi țintă principalul efect al estrogenului este acela de a iniția creșterea și diviziunea celulară (proliferarea celulară). În celulele țesutului din sân estrogenii declanșează proliferarea celulele care acoperă glandele secretoare in timpul alăptarii. Estrogenii determină proliferarea celulelor din endometrul uterin pregătind uterul pentru implatarea embrionului. În timpul ciclului menstrual nivelele de estrogen scad dramatic dacă nu apare nici o sarcină. Spre deosebire de celulele mamare normale, celulele cancerigene nu au întotdeauna receptori pentru estrogeni. Celulele canceroase care poseda receptori pentru estrogeni se numesc celule ER + (pozitive), in schimb cele care nu au receptori pentru estrogeni sunt celule estrogen-receptor – (negative). La femeile cu cancere estrogen receptor pozitive, cresterea acestor celule se află sub controlul estrogenilor. De aceea aceste cancere sunt de regulă sub tratamentul cu tamoxifen pentru ca acesta blochează receptorul respectiv. S-a descoperit astfel faptul ca structura receptorilor estrogeni este diferita de la un tesut la altul. Anumite medicamente care blochează acțiunea estrogenilor în anumite tesuturi, țn altele pot mima efectul lor. Aceste medicamente se numesc modulatori selectivi ai receptorilor estrogeni (SERM) pentru ca stimulează sau inhibă selectiv receptorii țn diferite țesuturi țintă. Un medicament SERM poate inhiba receptorul estrogen exprimat in celule din san, dar activează receptorul estrogen prezent în uter. Ca urmare poate activa proliferarea celulelor endometriale uterine. Primul SERM investigat pentru proprietățile sale anticancerigene este un medicament denumit tamoxifen. Tamoxifenul blochează acțiunea estrogenilor in țesutul din sâni, prevenind legarea moleculelor de estrogen la acest receptor. Cu toate acestea, tamoxifenul nu declanșează modificarea conformațională a receptorului, a.i proteinele activatoare sunt incapabile să se lege. Ca urmare genele care stimulează proliferarea nu pot fi activate. Interferând cu receptorii estrogeni in aceasta maniera, tamoxifenul blochează proliferarea celulară. Un alt SERM este raloxifenul (Evista®), un medicament aprobat de FDA in 1997 pentru prevenirea osteoporozei la femei aflate țn postmenopauză. Pare sa funcționeze ca și estrogenii în sistemul osos crescând densitata osoasă și intărind oasele, are de asemeni abilitatea de a scădea LDL colesterolul, scăzând si riscul bolilor cardiace. Informatiile despre efectele pe termen lung sunt mai limitate, date preliminare sugerează însă raloxifenul poate exercita aceste efecte benefice fara să crească riscul de apariție a cancerului.

Calea Ras-Raf-MAPK: se activează atunci când HER2 formează heterodimeri (EGFR / HER1-HER2). Această cale este un mediator important al proliferării celulare și al angiogenezei.

Angiogeneza tumorală

De regula pacienții diagnosticați cu cancer vor să știe în primul rând daca maladia este localizată sau s-a dispersat în alte zone ale corpului. Cancerul se diseminează prin metastaza, care reprezintă abilitatea celulelor canceroase de a penetra în vasele sangvine și limfatice, iar prin ele invadează și se dezvoltă în țesuturi aflate la distanță. Aceasta abilitate face cancerul o boala mortală, ca urmare există un interes extrem pentru înțelegerea fenomenului de metastazare.

Unul din evenimentele critice necesare metastazei este crearea unei noi unei rețele de vase sangvine. Procesul se numește angiogeneza. Proliferarea de noi vase de sânge are loc și la adulți, deși este un fenomen destul de rar. La femei, angiogenia are loc câteva zile pe luna când se formează noi vase de sânge. De asemeni angiogeneza este necesara pentru repararea și regenerarea țesuturilor in timpul refacerii unei râni.

Angiogeneza tumorală (Figura 18). cuprinde mai multe procese distincte:

1)   Stimularea celulelor endoteliale de diferiți factori proangiogenici ( bFGF=factor de creștere al fibroblastelor, VEGF). Acești factori proangiogenici pot fi secretați fie direct de celulele tumorale (ca răspuns la condițiile de hipoxie sau în urma activării de către oncogene), fie indirect (prin stimularea macrofagelor).

2)   Celulele endoteliale penetrează membrana bazală ce separă celulele endoteliale de țesutul subiacent, prin secreția de proteaze (activatorul tisular al plasminogenului: tPA, metaloproteinaze matriceale: MMP etc.)

3)   Migrarea celulelor endoteliale către sursa stimulului angiogenic

4)   Proliferarea celulelor endoteliale pentru a forma noi vase de sânge

5)   Secreția de componente ale membranei bazale care contribuie la remodelarea și formarea rețelei capilare

(http://www.imcr.uzh.ch)

Figura 18. Angiogeneza tumorală

Datorită rolului cheie pe care îl are angiogeneza în creșterea tumorală și metastază, acest proces a devenit o țintă promițătoare în dezvoltarea de noi terapii anti-cancer.

Mecanismul molecular al angiogenezei

Pentru a iniția procesul de vascularizare, factorii angiogenici se leagă de receptorii tirozin kinazici specifici exprimați pe suprafața celulelor endoteliale. Angiogeneza nu are loc prin interacțiunea unui singur ligand cu un receptor, ci este stimulată prin legarea simultană a mai multor factori proangiogenici de receptorii specifici. Factorii angiogenici acționează împreună cu citokine imflamatorii și proteine virale formând agregate moleculare în micromediul pericelular cu contribuția a diverși co-receptori, incluzând proteoglicani de tipul heparan sulfatului, integrine și gangliozide. Complexitatea acestor agregate este crescută și de faptul că receptorii factorilor angiogenici suferă dimerizare sau cuplare (fig. 18). După dimerizare are loc autofosforilarea receptorilor tirozin kinazici inițiând astfel mai multe căi de semnalizare prin activarea proteinelor de semnalizare (spre exemplu: PI3 kinaza, Src, Grb2/ m-SOS-1) și a semnalelor traductoare și a activatorilor de transcriere (STATs) care conțin domenii SH-2. Legarea regiunilor SH-2 a acestor proteine de tirozinele forsforilate de pe receptorul tirozin kinazic activează mai multe căi ce sunt cruciale în declanșarea ciclului celular. Cea mai cunoscută cale de semnalizare de acest tip este calea Ras-Raf-MAP kinazică (Figura 19). Proteina Ras este activată prin legarea de GTP și la rândul ei determină fosforilarea proteinei MEK care activează protein kinasa MAP (MAPK). În urma acestei cascade de semnalizare are loc activarea factorilor de transcriere din nucleu (myc, jun, fos).

 

Figura 19. Calea Ras-Raf-MAP kinazică activată de PDGF (factor de creștere derivat de la trombocite) (După Sebti și Hamilton, 2000)

După ce au fost stimulate, celulele endoteliale secretă o varietate de efectori (proteaze, glicozidaze și componente ale matricei extracelulare) ce creează un mediu propice pentru formarea unui nou vas de sânge. După ce au fost secretați, efectorii interacționează fie între ei, fie cu factorii angiogenici și receptorii acestora.

Pe lângă factorii angiogenici există și inhibitori ai angiogenezei. Aceștia sunt pot fi proteine, polizaharide și glicosfingolipide și sunt întâlniți în fluidele corporale și în matricea extracelulară. Acești inhibitori ai angiogenezei se leagă de receptorii tirozin kinazici specifici de pe suprafața celulelor endoteliale, scăzând astfel accesibilitatea acestora pentru factorii angiogenici (Figura 20).

 Figura 20. Interacțiunile moleculare din cadrul angiogenezei (după Rusnati și Presta, 2014). Factorii angiogenici secretați de celulele producătoare pot fi interceptate de un ligand liber (1) sau pot fi sechestrați de către matricea extracelulară (2). Unii factori proangiogenici dimerizează (3). La suprafața celulelor endoteliale, factorii angiogenici se leagă de co-receptori (4) și/sau receptorii tirozin kinazici (5) care suferă dimerizare/cuplare (6). Alternativ, de receptorii tirozin kinazici se pot lega antagoniști specifici, producând astfel marcarea receptorilor (7). Alți inhibitori se pot lega de receptori specifici de pe suprafața celulelor endoteliale declanșând semnale anti-angiogenici (8). Aceiași inhibitori pot fi reținuți în mediul extracelular (9). Celulele endoteliale activate eliberează efectori care interacționează cu mediul înconjurător.

Creșterea concentrației unui factor angiogenic nu este suficientă ca o celulă tumorală să devină angiogenică. Cu toate acestea este nevoie ca anumiți reglatori negativi sau inhibitori ai angiogenezei să fie represați. Dacă în mediul local factorii angiogenici predomină, noile vase sanguine pot persista ca și capilare, sau se pot diferenția în venule mature sau arteriole. În schimb, dacă în mediul local predomină factorii angiostatici, noile vase pot regresa. Deci, fenotipul angiogenetic este reglat prin modificarea echilibrului local dintre reglatorii pozitivi și negativi ai formării de noi vase de sânge, prin urmare, prin modificarea echilibrului concentrației de factori proangiogenici și de inhibitori ai angiogenezei.

După cum se observă, în angiogeneză sunt implicate un număr mare de interacțiuni complexe care au loc între proteine, glucide și lipide. Printre aceste nenumărate molecule implicate în acest proces există și molecule care pot interacționa simultan cu reglatori ai angiogenezei. O mai bună cunoaștere a acestor rețele complexe de interacțiuni care stau la baza neovascularizării este necesară pentru dezvoltarea unor strategii anti-angiogenice eficace.

1.4. Factorii proangiogenici

Factorii angiogenici sunt proteine cu funcții multiple, printre care reglarea proliferării celulare, migrarea, supraviețuire celulelor, geneza tumorală și repararea tisulară. În tabelul de mai jos sunt prezentate principalele roluri ale fiecărui factor angiogenic. Aceste proteine sunt secretate de celulele din tumoarea primară și de către macrofage. Chiar și celulele hematopoietice maligne secretă factori angiogenici în exces care favorizează creșterea și proliferarea celulară (2014-2-2001).

Tabel 1. Factorii proangiogenic- rolurile și căile de semnalizare a factorilor proangiogenici (După Palma și colab., 2011)

Factor proangiogenic	Roluri	Ținte
VEGF	Supraviețuire, proliferare, migrare, mobilizarea, permeabilitatea	Pcy1, MAPK-, FAK, P13K-AKT
bFGF	Proliferare, supraviețuire, încetarea creșterii, migrare, permeabilitate	MAPK/ERK, P13K-AKT, STAT, PLCγ1
PDGF	Vindecarea rănilor, dezvoltarea tumorală, proliferare, migrare	P13K-AKT, PLCγ1, ERK, Akt
Leptina	Supraviețuire, proliferare, răspunsul imun, limfopoieză	JAK-STAT, NF-kB
G-CSF	Reglarea granulopoiezei, supraviețuire, proliferare, activarea și maturarea neutrofilelor, creșterea fagocitozei, mobilizarea HPSC-urilor	JAK-STAT, RAS-MAPK
Folistatin	Proliferare, diferențiere, apoptoză, activarea reglajului	Proteinele Smad
Ang1	Vasculogeneza, supraviețuirea, germinarea și reorganizarea noilor vase, proliferare	Dok-R, ABIN-2
ANG	Formarea și creșterea tumorii	ERK1/2, PKB-AKT, SAPK-JNK
MK	Proliferare, migrare, anti-apotoză, mitogeneză, transformare, angiogeneză tumorală	ERK1/2, p38
PTN	Neovascularizare, geneză tumorală, proliferare, migrare	c-SRC, FAK, P13K și MAPK, fosforilarea β-cateninei
PGRN	Progresia ciclului celular, motilitat, reparare tisulară, geneza tumorală, inflamare	P13K, inhibă apoptoza
PLF	Migrare, proliferare, invazie	Cascada de semnalizare FGF/ STAT5/ PLF, JAK-STAT, MAPK
PIGF	Geneza tumorală, remodelarea vasculară într-o manieră dependentă de VEGF, limfangiogeneză, motilitatea celulelor tumorale	MAPK
Del-1	Aderența și migrarea celulelor endoteliale, recunoașterea fosfatidilserinei	RAS-MAPK

Datorită faptului că acești factori modulează comportamentul celular și modifică compoziția celulară în micromediul canceros, ei devin ținte esențiale în terapiile anti-cancer pentru a ajunge la remisia tumorală. (2014-2)

Abrevieri: ABIN2= inhibitor de legătură A2 a NF-kB, ANG= angiogenină, Ang1= angiopoietina 1, Ang2= angiopoietina 2, bFGF= factor de creștere fibroblastic fundamental, c-SRC= proto-oncogena proteinei tirozin kinaza Src, Del-1= locus endotelial de dezvoltare-1, ERK 1/2= kinaza reglată extracelular 1/2, FAK= kinaza de adeziune focală, FLRG= genă pentru folistatin, G-CSF= factor stimulator pentru creșterea colonială, HPSC= celule stem/ progenitoare hematopoietice, JAK/ Jak 2= tirozin kinază, JAK-STAT= kinaza Janus – traductor de semnal și activator al transcrierei, MAPK= protein kinaza mitogen activată, MAPK/ ERK= protein kinaza mitogen activată/ kinaza reglată extracelular, MK= midkine, NF-kB= factor nuclear enhancer-al-lanțului-ușor- kappa al limfocitelor B activate, p38= cale de semnalizare a unei protein kinază activate mitogen, PLCγ1= proteina fosfolipazei C-gamma, PDGF= factor de creștere derivat de la trombocite, PDGF-B= factor de creștere derivat de la trombocite B, PGRN= progranulină, P13K-AKT= fosfatidillinozitid3-kinaza-AKT, PIGF= factor de creștere derivat de la placentă, PKB-AKT= calea de semnalizare a protein kinazei B/AKT, PLF= proliferină, FGF= factor de creștere fibroblastic, PTN= pleiotropină, RAS- MAPK= RAS- protein kinaza mitogen activată, STAT= traductori de semnal și activatori ai transcrierii, VEGF= factor de creștere vascular endotelial, SAPK-JNK= protein kinază activată de stres/ Jun-amino-terminal kinaza.

Terapii antiangiogenice

În scopul de a împiedica formarea unor noi vase de sânge care să favorizeze progresia tumorală se folosesc o serie de agenți antiangiogenice. Aceștia sunt în mare parte inhibitori ai VEGF și sunt folosiți în clinică, de obicei împreună cu chemoterapia convențională. Totuși, terapiile antiangiogenice cresc doar cu un procent modest rata de supraviețuire și prezintă de cele mai multe ori efecte adverse toxice. Lipsa efectelor terapeutice de durată a terapiilor antiangiogenice se datorează rezistenței la acești agenți. Această rezistența este rezultatul mai multor cauze cum ar fi adaptarea tumorii la creșterea într-o manieră independentă de angiogeneză, selecția a mai multor celule tumorale maligne și invazive de către hipoxia indusă terapeutic și creșterea producerii de factori proangiogenici. Acești factori angiogenici pot fi aceeași cu cei țintiți și/sau alții.

S-au încercat mai multe abordării pentru a depășii această rezistență. Una dintre acestea se referă la optimizarea duratei de administrare a agenților antiangiogenici. O altă metodă constă în țintirea diferitelor căi de semnalizare implicate în angiogeneză.

Terapii cu inhibitori ai angiogenezei

Inhibitorii angiogenezei (sau factorii anti-angiogenici) acționează asupra mai multor ținte:

1)   inhibarea factorilor de creștere care promovează proliferarea celulară

2)   inhibarea proteazelor necesare pentru ca celulele endoteliale să penetreze membrana bazală și să formeze noi vase de sânge

3)   întrerupere căilor de semnalizare intracelulare specifice

4)   inducerea apoptozei celulelor endoteliale sau inhibarea supraviețuirii celulelor endoteliale

5)   inhibarea celulelor precursoare endoteliale din măduva osoasă

6)   inhibarea interacțiuni integrinei α_vβ₃-vitronectină care este pivotală în medierea adeziuni celulelor endoteliale la matricea extracelulară în timpul neovascularizării.

Inhibitori ai factorilor proangiogenici și ai receptorilor acestora

Una dintre cele mai numeroase clase de inhibitori ai angiogenezei este alcătuită din compuși care țintesc factorii proangiogenici (bFGF și VEGF). Acești factori au tendința de a se lega de heparină. Din acest motiv pot fi prinși la nivelul matricei extracelulare, determinându-le astfel disponibilitatea. Prima generație de medicamente sunt bazate pe compuși heparin-like (ex: Pentosan, polisulfat), în special datorită faptului că acești conțin mai multe sarcini negative care favorizează legarea factorilor de creștere.

Agenții care țintesc receptori pentru factorii de creștere, cum ar fi cei pentru FGF și VEGF, pot împiedica creșterea tumorală și metastaza interferând cu transducția stimului angiogenetic în răspunsul celular. În aceste căi de semnalizare, receptorii sunt de tip tirozin kinazic, de care ligandul se atașează la domeniul extracelular inducând autofosforilarea domeniului intracelular kinazic. Fiecare kinază funcționează apoi ca și un activator al semnalelor din aval. Pentru a întrerupe această secvență, s-au descoperit compuși care competiționează cu factorul de creștere pentru legarea la receptor, prevenind astfel autofosforilarea receptorului tirozin kinazic.

Terapii țintite VEGF

Familia VEGF este una dintre cele mai studiate datorită comportamentului lor molecular cu implicații în procesul malign. Această familie cuprinde liganzi, receptori și co-receptori. De exemplu, supraexprimarea liganzilor VEGF este asociată cu dezvoltarea tumorilor, progresia și metastaza.

VEGF poate crește permeabilitatea celulelor endoteliale crescând activitatea organitelor veziculare/vacuolare. Alternativ, VEGF poate crește permeabilitatea prin intermediul cascadei de semnalizare a MAP kinazei, slăbind joncțiunile dintre celulele endoteliale prin rearanjarea complexelor caderină/catenină. Creșterea permeabilității vasculare poate permite extravazarea proteinelor plasmatice și formarea de matrice extracelulară care favorizează migrarea celulelor endoteliale și stromale.

Datorită rolului său crucial în angiogeneză, VEGF a devenit țintă pentru primul medicament antiangiogenic care a fost aprobat de FDA. Acest medicament a fost folosit pentru tratamentul cancerului colorectal, un anticorp monoclonal umanizat anti-VEGF.

Pentru neutralizarea acțiunii angiogenice a VEGF au fost dezvoltate mai multe strategii ( Figura 21).

Figura 21. Strategii pentru neutralizarea VEGF (După Taraboletti și colab., 2010)

Inhibitorii pentru VEGF pot acționa reducând producerea de VEGF de către tumoare (1), interferând cu interacțiunea dintre VEGFR (receptorul pentru factorul de creștere endotelial vascular) și VEGF (2,3), reducând expresia VEGFR (4), inhibând căile de semnalizare intracelulare induse de VEGFR (5).

1) Inhibarea sintezei de VEGF cu ajutorul ADNc antisens. Acesta conține o secvență specifică de nucleotide, care se leagă ARNm pentru VEGF și interferă cu traducerea ARNm și cu sinteză proteinelor VEGF.

2) Sechestrarea VEGF în mediul extracelular cu ajutorul anticorpilor monoclonali anti-VEGF și receptorilor VEGF solubili. Anticorpii monoclonali anti-VEGF neutralizează direct proteinele VEGF și blochează activitatea biologică. Receptorii solubili se leagă specific de VEGF și blochează indirect interacția dintre VEGF și VEGFR (recptorul factorului de creștere endotelial vascular).

3) Mascarea VEGFR prin intermediul inhibitorilor acestora. Acești inhibitori se leagă de VEGFR și blochează interacțiunea dintre acesta și VEGF. Acești inhibitori sunt reprezentați de anticorpi monoclonali, cum ar fi anticorpii monoclonali anti-KDR (recptor inserat cu domeniu kinazic) care competiționează cu VEGF pentru atașarea la VEGFR2. (79)

4) Reducerea.expresiei VEGFR este mediată de o enzimă (DNAzyme) care inhibă proliferarea celulelor endoteliale concomitent cu reducerea ARNm pentru VEGFR2 și scade creșterea tumorală în vivo.

5) Inhibarea transducției semnalului. Calea de semnalizare este întreruptă prin blocarea autofosfărilării VEGFR.

Terapii țintite FGF-2

FGF-2 a fost primul factor proangiogenic asociat cu formarea de tumori care a fost purificat (1971 de către Folkman și colab).

Supraexprimarea sau mutațiile duc la o dereglare în activarea receptorilor pentru FGF și a căilor de semnalizare în care aceștia sunt implicați. Concentrația din sânge a FGF este ridicată la pacienții bolnavi de cancer, în unele cazuri este asociată cu supraviețuirea tumorii după o terapie antiangiogenică. FGF facilitează progresia tumorală atât direct, afectând diferențierea celulelor tumorale, proliferarea, supraviețuirea, invazia, metastaza, răspunsul la chemoterapie, cât și indirect prind inducerea angiogenezei și prin recrutarea și activarea celulelor stromale. Prin urmare, țintirea lui FGF afectează simultan mai multe căi asociate cu progresia tumorală, angiogeneza și rezistența tumorală.

Sunt cunoscuți 22 de membri ai familiei FGF. Din aceștia 18 sunt definiți ca și liganzi și 4 sunt factori omologi FGF. FGF acționează asupra mai multor tipuri de celule autocrin, paracrin sau juxtacrine. Pot fi recunoscuți de mai mulți receptori, printre care: receptori tirozin kinazici, proteoglicani de tipul heparan sulfatului (HSPG), integrine și gangliozide. FGF-1, 2, 4, 5 și au activitate proangiogenică.

Activitatea angiogenică a FGF poate fi neutralizată prin mai multe strategii (fig.22).

 

  Fig. 22. Strategii pentru neutralizarea FGF.(După Taraboletti și colab., 2010)

Inhibitorii pentru FGF pot acționa reducând producerea de FGF de către tumoare (1), interferând cu recunoaștere de către FGFR (receptorul pentru factorul de creștere fibroblastic) (2,3), afectând expresia FGFR (4), inhibând căile de semnalizare intracelulare induse de FGF (5) sau acționând asupra efectorilor angiogenezei (6).

1) Inhibarea sintezei de FGF se realizează prin ADNc antisesns sau mutante dominant negativ ale FGF.

2) Sechestrarea FGF în mediul extracelular împiedică stimularea celulelor țintă. Acesta se realizează cu anticorpi anti-FGF sau cu „capcane FGF”, concepute să imite secvența moleculară a FGFR. Cunoscându-se că oprțiunea extracelulară solubilă a FGFR1 leagă FGF-2 și previne interacțiunea dinte FGF-2/FGFR1 adus la „construirea” FP-1039, o proteină de fuziune care conține domeniul extracelular FGFR1-IIIc fusionat cu domeniul Fc al IgG1 (imunoglobulina G1).

Heparina sechestrează FGF în mediul extracelular și competiționează cu legarea factorului de creștere la HSPG. Cu toate că exercită un efect antagonist cu FGF, heparina nemodificată nu poate fi utilizată ca și agent anti-angiogenic din cauza activității sale anticoagulante și a capacității sale de a lega o gamă largă de molecule. Acest fapt a dus la dezvoltarea heparinei sintetice care derivă de la molecule heparin-like (cum ar fi suramina) dotate cu o activitate antagonistică cu FGF mult mai specifică. Printre derivații diferiți structural, se numără și acidul gentisic (acidul 2,5-dihidroxibenzoic), un metabolit secundar produs de plante și un catabolit al aspirinei, care leagă situsul de legare la heparină a FGF și este utilizat ca și tipar pentru dezvoltarea de noi inhibitori ai angiogenezei.

3) Mascarea FGFR se poate face cu anticorpi specifici direcționați împotriva receptorilor sau cu protamine sau peptide sintetice care corespund secvențelor de recunoaștere a FGF. HSPG poate fi mascat de protamină, glicoproteină bogată în histidină, PF4 (factorul plachetar 4), edostatin și kalistatin. Interacțiile FGF cu integrinele sunt mascate de peptide sintetice și disintegrine ( o clasă de antagoniști naturali ai integrinelor).

4) Reducerea expresiei FGFR se face cu ajutorul ADNc antisens, fenretinide retinoide sintetice și anticorpi direcționați asupra integrinelor α_vβ₃ și α₅β_1.

5) Inhibarea transducției semnalului. Activitatea tirozin kinazică a receptorilor factorilor proangiogenici poate fi țintită pentru a afecta angiogeneza. Majoritatea inhibitorilor tirozin kinazici au un spectru de activitate foarte larg, afectând mai mulți receptori și căi de semnalizare. Spre exemplu, SU5402, care țintește atât VEGFR-2, cât și FGFR1 și FGFR3.

6) Inhibarea efectorilor se realizează cu ajutorul compușilor sintetici, ADNc antisens sau mutante dominant negativ ale FGF.

Inhibitori endogeni ai angiogenezei

Au fost caracterizați mai mult de 40 de inhibitori endogeni ai angiogenezei. Aceștia au fost împărțiți în 4 clase majore:

• Interferoni (IFN)
• Fragmente proteolitice
• Interleukine (IL)
• Inhibitori tisulari ai metaloproteinazelor (TIMP)

Interferonii

Interferonii (TNF-α, TNF-β și TNF-γ) fac parte dintr-o familie de glicoproteine secretate, care au efect inhibitor direct sau indirect asupra angiogenezei tumorale.

S-a constatat că IFN-α/β reglează expresia factorului pro-angiogenic MMP-9. Acesta reduce transcrierea ARNm pentru MMP-9 și sinteza acestei proteine. De asemenea, IFN-α/β reduce expresia IL-8 în cancerul de vezică urinară. Studiile au demonstrat că administrarea unei doze optime de IFN-α/β scad sinteza de bFGF și densitatea microvaselor în tumori și, în plus, induce apoptoza celulelor endoteliale.

A fost demonstrat că IFN-γ are efecte inhibitorii slabe asupra sintezei de VEGF și bFGF și că IFN-α nu reduce semnificativ nivelul de VEGF sau bFGF în carcinomul cu celule renale.

Totuși, au fost studii care au arătat că tratamentul cu IFN-α/β nu cauzează reducerea nivelului de bFGF și VEGF din sângele pacienților cu tumori carcinoide și leucemie. Așadar, efectele antiangiogenice ale tratamentelor ce au la bază IFN pot fi mediate de reglajul diferiților factori proangiogenici. În plus, se presupune că IFN-γ își induce efectele anti-angiogenice prin secreția proteinei 10 imductibile de IFN-γ (IP-10) și de monokine induse de IFN-γ.

Interferonii prezintă proprietăți antitumorale, care pot fi mediate printr-un efect citotoxic direct asupra celulelor, creșterea imunogenității tumorii prin creșterea expresiei CMH (complex major de histocompatibilitate) de clasă I și II și a genelor pentru antigenele asociate tumorii, și/sau activarea macrofagelor, a limfocitelor T și a limfocitelor NK (natural killer).

Fragmentele proteolitice

Cele mai multe fragmente proteolitice sunt derivate de la componentele matricei extracelulare, cum ar fi colagenul și fibronectina, sau de la enzime care remodelează matricea extracelulară precum plasminogenul sau MMP-2. Cei mai bine caracterizați inhibitori din această clasă sunt angiostatin și endostatin.

Angiostatin este un fragment de 38 kDa derivat de la plasminogen. Acesta are abilitatea de a reduce expresia VEGF în tumoare. Angiostatin inhibă HGF (factor de creștere al hepatocitelor), induce fosforilarea a c-met, Akt și ERK1/2. Își exercită astfel efectul anti-angiogenic prin întreruperea căi de semnalizare HGF/c-met.

Administrarea intraperitoneală de angiostatin are potențialul de a inhiba neovascularizarea și metastaza. Acest lucru a fost observat la șoareci după ce tumoarea primară a fost îndepărtată.

A fost demonstrat că legarea de angiostatin la subunitățile α/β a ATP sintazei de la nivelul membranei plasmatice suprimă sinteza de ATP la nivel endotelial, având astfel efect anti-angiogenic și de reducere a proliferării și migrării celulelor endoteliale. Transferul genei mediate adenoviral care codifică angiostatin inhibă selectiv proliferarea celulelor endoteliale și întrerupe tranziția G₂/M indusă de factorii promotorii ai fazei M. Alte studii au arătat că tratamentele cu angiostatin cresc semnificativ apoptoza celulelor endoteliale și a celulelor tumorale și scad densitatea tumorilor în vasele de sânge. S-a constatat că angiostatin produce o creștere tranzitorie în ceramide care este corelată cu reorganizarea fibrelor de actină, detașarea și moartea acestora și, în plus, tratamentul cu angiostatin și ceramide are ca rezultat activarea RhoA, un efector important al structurii citoscheletului. Agiostatin poate să și reducă selectiv expresia selectinei E și să inhibe deci proliferarea celulelor endoteliale.

Endostatin este un fragment de 20 kDa al colagenului de tip XVIII. Acesta inhibă proliferarea celulelor endoteliale, angiogeneza și creșterea tumorală. Mecanismele prin care endostatin inhibă proliferarea și migrarea indusă de VEGF sunt:

• blocarea autofosforilării VEGFR2
• suprimarea activării ERK, p38 MAPK și p125^FAK indusă de VEGF
• inhibarea legării VEGF de receptorii specifici de pe suprafața celulele endoteliale
• legarea endostatinului de VEGFR2, dar nu și de VEGF

A fost demonstrat că endostatin se poate atașa la integrinele α_v și α₅, inhibând astfel funcția acestor integrine, cum ar fi migrarea celulelor endoteliale. Endostatinul poate și competiționa cu bFGF la legarea de HSPG, ceea ce poate duce la întreruperea căii de semnalizare. Endostatin induce o scădere semnificativă a proliferării celulelor endoteliale în stadiul de bază și după stimularea cu neuropeptide Y și bombesin. Endostatin inhibă activarea extracelulară a MMP-2 prin inhibarea MT1-MMP (metaloproteinaza de tip membranar 1) și activitatea catalitică a MMP-2 și poate bloca astfel invazibilitatea celulelor endoteliale și tumorale. Activitatea proapoptotică a endostatinului se pare că e mediată de o cale de semnalizare tirozin kinazică și prin reducerea exprimării proteinelor antiapoptotice bcl-2 și bcl-XL fără să afecteze nivelul de proteină proapototică Bax.

Interleukinele

Interleukinele care au la capătul –NH₂ terminal motivul Glu-Leu-Arg, precum IL-8, au propretații proangiogenice, iar cele cărora le lipsește acest motiv, de exemplu, IL-4, inhibă angiogeneza. IL-4 inhibă ,in vivo, neuvascularizarea indusă de bFGF în corneea de la șoareci și blochează migrarea celulelor endoteliale microvasculare către bFGF in vitro. Cu toate acestea, a fost demonstrat că IL-1α, o citokină secretată de macrofagele activate, induce angiogeneza prin creșterea expresiei mai multor factori proangiogenici cum ar fi VEGF, IL-8 și bFGF. De asemenea, s-a constatat că IL-6 contracarează efectele apoptotice mediate de p53. Mai multe studii au arătat că IL-12 suprimă expresia VEGF, bFGF și MMP-9. Tot IL-12 stimulează expresia IFN-γ și a chemokinei IP-10. IL-12 provează apoptoza și reduc rata de proliferare în tumorile umane. În vivo, inhibarea neovascularizării la tumorile care secretă IL-10 poate fi mediată prin abilitatea IL-10 să reducă sinteza de VEGF, IL-1β, TNF-α, IL-6 și MMP-9 de către macrofagele asociate tumorilor. De asemenea, IL-10 inhibă metastază printr-un mecanism dependent de limfocitele NK.

Inhibitori tisulari ai metaloproteinazelor

Componentele matricei extracelulare remodelate cuprind un eșafod pe care celulele endoteliale pot adera, migra, forma tuburi și depunerea acestor componenți formând lamina bazală a celulelor endoteliale și murale. In vitro, migrarea celulelor endoteliale prin gelatină este redusă semnificativ de către TIMP-1 care este supraexprimat. În literatura de specialitate este raportat faptul că TIMP-2 este cel care poate inhiba proliferare indusă de bFGF. TIMP-2 poate inhiba și FGFR1 solubil eliberat de MMP-2. Studiile au demonstrat că supraexprimarea a TIMP-3 induce moartea celulelor apoptotice la un număr mare de linii celulare canceroase și la celulele musculare netede vasculare la șoareci prin stabilizarea receptorilor de pe suprafața celulelor pentru TNF-α. Se pare că efectele antiangiogenice ale TIMP-3 sunt mediate prin scăderea expresiei caderinei endotelial vasculare în celulele endoteliale. TIMP-1, TIMP-2 și TIMP-3 inhibă neovascularizarea inhibând MMP-1, MMP-2 și MMP-9 inducând ruperea matricei înconjurătoare. Datorită acestor efecte ale TIMP asupra celulelor endoteliale și tumorale MMP-urile sunt considerate ținte atractive în dezvoltarea terapiilor anticancer.

2.1.2.5. Tromospodin-1 (TSP-1)

TSP-1 a fost primul inhibitor endogen al angiogenezei identificat. La mamifere, familia TSP este compusă din 5 membri, proteinei modulare. TSP-1 este o proteină matriceală, adică o proteină extracelulară non-structurală care are rol în reglarea interacțiunilor celulei cu mediul. TSP-1 este un monomer care are mai multe domenii diferite, putând astfel să interacționeze simultan cu diferiți receptori celulari, citokine solubile, factori de creștere și proteaze. (2011)

TSP-1 își exercită activitatea antiangiogenică prin legarea de receptorul CD36, declanșând un semnal apoptotic. Legarea TSP-1 la receptorul CD36 duce la recrutarea kinazei asociată cu Src, p59-fyn și la activarea p38 MAPK. Activarea p38 MAPK s-a dovedit că este p59-fyn-dependentă și necesită activitatea proteolitică a caspazei-3. Activarea p38 MAPK duce la activarea caspazei-3 și a apoptozei. Efectul apoptotic al TSP-1 este redus la celulele endoteliale activate și nu la cele pasive. Prin intermediul receptorulu CD36, TSP-1 poate modula activitatea FAK (kinaza de adeziune focală) și inhiba migrarea și proliferarea celulelor endoteliale. TSP-1 poate inhiba chemotaxia în vitro și neovascularizarea în vivo, indusă de o serie de factori proangiogenici. Aceștia includ proteine care acționează prin intermediul receptorilor tirozin kinazici (VEGF, bFGF, PDGF), prin intermediul proteinelor G (IL-8), prin intermediul receptorilor serin-treonin kinazici (TGF-β: factor de creștere tumoral β) și prin intermediul lipidelor (PGE-1: prostaglandina E-1).

Somatostatina și analogii

Somatostatina (SS) este un hormon secretat de pancreas (celulele delta din insulele Langerhans), celulele neuroendocrine ale tubului digestiv și de către hipotalamus (nucleul periventricular). SS are un efect inhibitor asupra secreției de insulină și de glucagon de la nivelul pancreasului.

Somatostatina inhibă proliferarea în neoplasmul endocrin. Mecanismele de acțiune ale SS și analogilor în inhibarea creșterii tumorale sunt:

• inhibarea secreției de hormoni (de exemplu: GH = hormon de creștere, insulina și/sau hormoni gastrointestinali)
• inhibarea directă sau indirectă (prin intermediul GH) a IGF-1 (factor de creștere insulin-like) și/sau a altor factori de creștere care au un efect stimulator în creșterea tumorală. Pe de altă parte, analogii SS pot stimula selectiv formarea proteinei 1 de legare IGF, interferând astfel cu acțiunea IGF-1 la nivelul receptorului
• inhibarea angiogenezei prin mecanisme diverse
• efecte antimitotice directe asupra factorilor de creștere, care acționează ca și receptori tirozin kinazici precum EGF (factor de creștere epidermal) sau FGF, prin intermediul SSTR de pe suprafața celulelor tumorale
• modularea activității imunologice

Acțiunea antiproliferativă a SS este semnalizate prin intermediul căii din care fac parte 5 receptori specifici cuplați cu proteine G (SSTR1-SSTR5: receptori pentru somatostatină). S-a constatat că activarea lui SSTR1, SSTR2, SSTR4 și SSTR5 bochează ciclul celular în faza G1 prin indermetiul capacității SS să mențină un nivel ridicat de CDKI p27^(Kip1) și p21 (inhibitor ai kinazei ciclin dependente) și inactivează complexele ciclina E-CDK2 (kinaza ciclin dependenda 2), determinând hipofosforilarea lui pRb. SS poate stimula direct apoptoza celulelor tumorale prin calea de semnalizare dependentă de SSTR3-proteina G, cauzând activarea genei p53 și a proteinei proapototice Bax.

Imunoterapia

Imunoterapia se referă la tratamentul cancerului prin manipularea sistemului imun al pacientului. Acest lucru se bazează pe cunoștințele despre micromediul tumoral, adică mediul în care celulele tumorale trăiesc și despre ce alte celule trăiesc alături de ele. Cum am menționat în ultimul curs celulele tumorale evoluează permanent; până la momentul când o persoană este diagnosticată cu cancer, tumora conține deja multe populații diferite de celule și fiecare populație are o combinație unică de mutații în interiorul ei. În plus, celulele canceroase dintr-o tumoră nu trăiesc singure. De fapt, tumorile conțin multe diferite tipuri de celule, iar celulele canceroase sunt adesea depășite de alte tipuri de celule.

În primul rând, când oamenii de știință vorbesc despre celulele non-canceroase care trăiesc în tumori, ei se referă la ele ca „celule stromale”. Tipul, numărul și varietatea de celule stromale dintr-o tumoră variază de la cancer la cancer și de la pacient la pacient. Celulele stromale includ în mod obișnuit celule structurale denumite fibroblaste, leucocite, celule musculare netede, celule epiteliale și celule din țesutul adipos, care sunt cunoscute sub numele de adipocite. Tumorile conțin și vase de sânge sau vase limfatice. Vasele de sânge care se dezvoltă într-o tumoră sunt esențiale pentru supraviețuirea celulelor canceroase, pentru că aduc un aport de oxigen și nutrienți. Unele dintre celulele stromale din tumoră vor fi fost în țesut înainte de a crește tumora; altele (ca. multe leucocite) vor fi fost atrase mai târziu de tumoră.

În loc să fie distruse de celulele albe din sânge, celulele canceroase au învățat să trăiască alături de ele și chiar să prospere în compania lor. Asta nu înseamnă că acest lucru se întâmplă întotdeauna. De fapt, oamenii de știință cred că sistemul nostru imunitar joacă un rol vital în distrugerea celulelor canceroase și prevenirea creșterii și metastazării unei tumori. Deci, numai atunci când protecția normală oferită de sistemul nostru imunitar nu funcționează corect, dezvoltăm un cancer care pune viața în pericol.

Există trei aspecte ale modului în care interacționează celulele canceroase și sistemul imunitar pe care le vom aborda în această secțiune.

În primul rând, modul în care celulele canceroase trăiesc alături de celulele albe din sânge, în al doilea rând, modul în care celulele canceroase se ascund de celulele albe din sânge și, în al treilea rând, modul în care celulele canceroase suprimă celulele albe din sânge. Aceste lucruri se află în centrul relației cancerului cu sistemul imunitar.

Două dintre ele - modul în care celulele canceroase se ascund și suprimă celulele albe din sânge - se află, de asemenea, în centrul noilor abordări de imunoterapie pentru cancer. Deci, mai întâi să ne uităm la modul în care celulele canceroase trăiesc și chiar prosperă în prezența a milioane de celule albe din sânge. Primul lucru de realizat este că avem multe tipuri diferite de celule albe din sânge.

Unele dintre ele, în special cele implicate în inflamație, par să ajute adesea celulele canceroase, producând o gamă largă de proteine de semnalizare, cum ar fi citokinele și prostaglandinele. Acești „băieți răi” includ unele dintre macrofage și mastocitele.

Celulele canceroase pot atrage, de asemenea, o mulțime de celule albe din sânge care suprimă în mod activ alte celule albe din sânge, acestea includ celule supresoare derivate din mieloide și celule T reglatoare. Prezența multor dintre aceste globule albe supresive este adesea un semn că cancerul va fi agresiv și probabil se va răspândi. Și asta pentru că, pe lângă faptul că susțin și încurajează celulele canceroase, acești „băieți răi” suprimă în mod activ orice „băieți buni” - celule care încearcă să lanseze un atac împotriva celulelor canceroase. Băieții buni” sunt în general celule dendritice și celule T citotoxice care împreună pot lupta și chiar distruge o tumoare. Și asta ne aduce la a doua parte a acestui curs- modul în care celulele canceroase se ascund de sistemul imunitar. Capacitatea organismului de a lansa un atac eficient și precis împotriva celulelor canceroase se bazează adesea pe celulele dendritice. Celulele noastre dendritice sunt celule de patrulare sunt în afara țesuturilor, adunând proteine din mediul lor și apoi ducându-le înapoi la celulele T din ganglionii limfatici din apropiere.

Prin urmare, celulele dendritice se pot deplasa în jurul unei tumori și pot prelua fragmente de proteine mutante din celulele canceroase. Apoi pot încărca aceste fragmente pe proteinele MHC de pe suprafața lor, se deplasează către ganglionii limfatici din apropiere și de aici caută celulele T ai căror receptori pot recunoaște fragmentele de proteine mutante afișate lor de către celula dendritică. Și dacă găsesc o celulă T și o activează, acea celulă T se va înmulți rapid, se va muta în tumoare și va oferi un răspuns imunitar împotriva cancerului. De fapt, prezența multor celule Tc într-o tumoare, cunoscută și sub numele de celule T infiltrante, este, în general, un lucru bun - este un semn că sistemul imunitar luptă împotriva cancerului.

Cum este atunci posibil ca celulele canceroase să evite să fie distruse de celulele T? Ei bine, unul dintre lucrurile pe care le pot face celulele canceroase este să evite afișarea oricărei proteine mutante pe suprafața lor. Un alt lucru pe care îl pot face este să suprime orice celule T care încearcă să le distrugă. Această suprimare a celulelor T ucigașe se face de către T-regs și celulele supresoare derivate din mieloide. Dar se face și prin declanșarea proteinelor punctului de control pe celulele T.

În primul rând, celulele canceroase prosperă prin atragerea a milioane de celule albe din sânge inflamatoare și imunosupresoare care eliberează o mulțime de proteine de semnalizare.

În al doilea rând, se ascund eliminând proteinele defecte de pe suprafața lor.

Și în al treilea rând, acestea suprimă orice celule albe din sânge care le apar în cale și care luptă cu cancerul.

Mai mult, celulele noastre T sunt acoperite de aceste proteine și multe altele diferite.

De exemplu CD28, sunt necesare pentru ca celulele T să devină active. Când receptorul celulei T recunoaște un fragment proteic afișat de o celulă dendritică, celula T nu va deveni activă decât dacă B7 un receptor de pe celula dendridică și CD28 se conectează.

Dar dacă celulele T devin supraactive sau sunt active prea mult timp, vor începe să distrugă țesuturile sănătoase. Deci, celulele noastre T au la suprafață alte proteine denumite proteine ale punctului de control pe care corpul nostru le folosește pentru a opri activitatea celulelor T.

Figura 23. Interacțiunea celulelor tumorale cu celulele T.

 Când o celulă T și-a terminat treaba, macrofagele intră în acțiune prin două proteine pe suprafața lor numite PD-L1 și PD-L2 pentru a opri celula T. Acestea fac acest lucru declanșând o altă proteină inhibitoare a punctului de control pe celulele T numită PD-1.

Figura 24. Interacțiunea celulelor tumorale cu macrofagele.

Oamenii de știință au descoperit că celulele canceroase dintr-o mare varietate de tumori au, de asemenea, PD-L1, uneori PD-L2, pe suprafața lor. Mai mult, celulele dendritice din tumori le exprimă și ele. Și aceste celule își folosesc PD-L1 și PD-L2 pentru a opri celulele T care încearcă să atace și să distrugă celulele canceroase. Deci CTLA-4 și PD-1 sunt ambele proteine inhibitori ai punctelor de control. Și dacă sunt declanșate, acestea blochează celulele T.

Figura 25. Interacțiunea celulelor tumorale cu macrofagele și celulele dendritice.

Anticorpii care împiedică declanșarea CTLA-4 și PD-1 - așa-numiții „inhibitori ai punctelor de control” - devin tratamente importante pentru cancer. De exemplu, ipilimumab, care blochează CTLA-4, este acum un tratament standard pentru melanomul malign. Previne suprimarea celulelor T de către celulele dendritice. Și nivolumab și pembrolizumab, care ambele blochează PD-1, sunt de asemenea autorizate pentru melanomul malign și cancerul pulmonar cu celule mici. Și nivolumab este, de asemenea, autorizat pentru tratamentul cancerului de rinichi.

Figura 26. Inhibitori ai punctelor de control.

În cele din urmă, atezolizumab, care blochează PD-L1, care se găsește atât pe suprafața celulelor canceroase, cât și a celulelor albe din sânge, este autorizat în Statele Unite, și Europa, pentru tratamentul cancerului de vezică urinară.

Scopul tuturor acestor anticorpi este de a preveni blocarea celulelor T care luptă împotriva cancerului și de a le menține active suficient de mult timp pentru a distruge milioane de celule canceroase și, sperăm, să beneficieze pacientul.

Înainte de a termina, există câteva lucruri importante de reținut despre inhibitorii punctelor de control. În primul rând, vor funcționa numai dacă sistemul imunitar al pacientului încearcă deja să lupte împotriva cancerului cu celule T. Dacă nu există celule T în organism care să recunoască și să distrugă celulele canceroase, atunci un inhibitor al punctului de control nu are cu ce lucra și pur și simplu nu își poate face treaba corect.

Înainte de a termina, există câteva lucruri importante de reținut despre inhibitorii punctelor de control.

În primul rând, vor funcționa numai dacă sistemul imunitar al pacientului încearcă deja să lupte împotriva cancerului cu celule T. Dacă nu există celule T în organism care să recunoască și să distrugă celulele canceroase, atunci un inhibitor al punctului de control nu are cu ce lucra și pur și simplu nu își poate face treaba corect.

În al doilea rând, celulele canceroase cu cele mai multe mutații ale ADN-ului în interiorul lor par a fi cele mai vulnerabile la inhibitorii punctelor de control și asta poate pentru că sunt cele mai vizibile pentru sistemul imunitar.

În al treilea rând, mediul tumoral este extrem de imunosupresor și chiar dacă se activează milioane de celule T, acestea s-ar putea să nu fie suficiente pentru a câștiga bătălia și pentru a distruge suficiente celule canceroase care să beneficieze pacientul.

În al patrulea rând, efectele secundare pe care le provoacă inhibitorii punctelor de control se datorează adesea răspunsurilor imune nedorite cauzate de celulele T supra-active. În cele din urmă, aceste tratamente provoacă o mulțime de entuziasm, nu în ultimul rând, deoarece beneficiile lor pot fi de lungă durată, în special pentru persoanele cu melanom malign, și există de fapt mii de oameni în viață astăzi datorită acestui grup de tratamente.

Terapia cu celule adoptive CAR-T

Pentru ca celulele T să devină active au nevoie de două semnale de la celulele dendritice: Receptorul lor trebuie să recunoască un fragment proteic afișat de o celulă dendritică., iar proteina CD28 a celulei T trebuie să se conecteze cu B7. Doar odată ce aceste două lucruri au avut loc, celula T va fi gata să-și urmărească ținta. Cu toate acestea, scopul transferului de celule adoptive este de a crea o armată de celule T care pot distruge celulele canceroase fără a fi necesară activarea de către o celulă dendritică.

Așadar, oamenii de știință au creat receptori falși ai celulelor T care se pot atașa direct la proteinele de pe celulele lor țintă și pot da semnale de activare celulei T. Receptorul fals (numit receptor antigen himeric - CAR) este o proteină mix-and-match fabricată dintr-o parte a unui anticorp plus bucăți de alte proteine.

Figura 27. Terapia -CAR-T

Concluzii și sumar al imunoterapiilor

Imunoterapia în cancer

Sistemul imunitar este o rețea complexă de celule, țesuturi și organe, cu rol de apărare a organismului împotriva agresiunilor de orice natură, fiind supus continuu influenței mediului extern. Termenul de imun își are originea în limba latină, unde ,,imunis” înseamnă liber, curat. Sistemul imun devine din ce în ce mai complex în evoluție, cel mai dezvoltat fiind la mamifere. El distruge atât corpii străini (antigene non-self), cât și structuri proprii alterate, îmbătrânite sau tumorale, contribuind astfel la menţinerea stării de sănătate a organismului.

ORGANE LIMFOIDE
Primare		Secundare
Maduva osoasă hematogenă	Timus	Splină	Ganglioni limfatici	Ţesut limfoid asociat mucoaselor
				Individualizat: -amigdale -plăci Peyer -apendice   vermiform	Structuri endoepiteliale difuze: -MALT -GALT -BALT -SALT

 

Limfocite (B, T, non B,T=NK):

Ø localizate în organe limfoide şi circulaţia sanguină şi limfatică

Ø au origine mezenchimală în sacul vitelin şi ficat la embrion, şi în măduva osoasă la adult

Ø sunt de 100 de ori mai numeroase decât neuronii

Ø reprezintă baza diversităţii şi specificităţii răspunsului imun

Ø limfocitele B produc anticorpi, iar cele T citokine

Ø cea mai interesantă celulă a vertebratelor

T			B	NK=natural killer
Th=CD4+ (helper)	Ts=suppresor	Tc=CD8+     (citotoxicitate)
Marker:CD 4 (T4),      TCR	Markeri: TCR	Marker: CD8 (T8),        TCR	Mulţi	CD3, CD56
Activare: Ag+ CMH II	Activare: Th	Activare: Ag+ CMH I	Activare Ag+ Th	Activare: Th
Rol: diferenţiere Tc, NK, macrofage, determină secreţia IL-2, INF, etc	Rol: inhibă acţiunea Th, toleranţa self	Rol: acţiune citotoxică asupra celulelor tumorale sau infectate cu virusuri, fungi, bacterii	Rol: produce Ac care elimină tumorile (ADCC)	Rol: ucid fără intervenţia Ac şi CMH tumorile

Termenul de „glonț magic” utilizat în terapia cancerului a fost introdus de Paul Ehrlich la sfârșitul secolului XIX ca o referire la anticorpii care anihilează atât microorganismele cât și celulele tumorale. Teoria supravegherii imune a tumorilor, enunțată inițial de Ehrlich, apoi reluată de Burnett şi Thomas recunoaşte rolul major în controlul apariţiei şi proliferării tumorilor. Această teorie ar putea explica creşterea frecvenţei tumorilor, paralel cu diminuarea eficacităţii apărării imune odată cu vârsta.

Odată cu noile modele experimentale şi creşterea volumului cunoştinţelor de genetică, au fost obţinute modele experimentale, care indica că atât rezistenţa naturală cât şi cea adaptativă au rol în controlul dezvoltării şi progresiei tumorale. Interacţiunea dintre tumoră şi organismul-gazdă implică sistemul imun la niveluri variate.

Terapiei imuna a cancerului se bazează pe faptul că tumora exprimă un profil antigenic distinct de celula normală şi, astfel, sistemul imun este capabil să recunoască aceste diferenţe antigenice .

Celulele tumorale diferă de celulele normale, atât prin compoziţia antigenică, cât şi prin comportamentul biologic. Instabilitatea genetică survenită în urma mutaţiilor în ADN, este una din „emblemele” fenotipului malign şi determină apariţia de antigene tumoral-specifice (TSA), întâlnite doar pe celula tumorală. TSA fac parte din clasa de antigene asociate tumorilor ( TAA). TAA, normal se regăsesc în celula normală în numar foarte redus. TAA devin periculoase când expresia lor este foarte crescută în celula normală şi sunt molecule asociate unei mari varietăţi de cancere (proteina Ras, p53). TAA şi TSA sunt folosite în imunoterapia cancerului, ca ţinte (anticorpi monoclonali).

Bazele moleculare ale recunoașterii celulelor tumorale de sistemul imun în imunitatea adaptativă (umorală şi celulară)

Antigenele TSA sunt prezentate celulelor imune de celulele prezentatoare de antigene (APC), adică celule dendritice şi macrofage şi sunt recunoscute de receptori de pe limfocite (Ig imature în cazul limfocitelor B, sau TCR-T cell receptors, pentru limfocitele T). Limfocitele Th exprimă pe suprafaţa lor antigene, dar şi receptori pentru antigene (TCR), care recunosc şi se leagă de TSA de pe celula tumorală. În urma acestei interacţiuni, are loc activarea limfocitelor Tc, care vor secreta enzime şi citokine. Aceste molecule citotoxice distrug celulele canceroase. Limfocitele B sunt activate de contactul lor cu antigenul tumoral, şi prin intermediul Th, ele se transformă în plasmocite secretoare de anticorpi, care sunt efectori majori în rejectarea celulelor tumorale, în special Ig M.

Imunitate antitumorală naturală (înnăscută)

•  Celule NK (natural killer)

celule killer native (activitatea lor nu depinde de o imunizare anterioară)

-        sunt activate direct de tumori sau de produşii celulelor Tc ( IL-2)

-        nu exprimă molecule CMH

-        numărul lor scade în metastaze

-        produc citokine (IL, IFNγ, etc)

• Celule dendritice (DC)
• Macrofage

-activate de IFN-γ, secretă oxid nitric şi TNFα (citotoxicitate)

-opsonizate cu Ig G

 Mecanismele de evaziune tumorală

 TOLERANŢA IMUNĂ

   -inhibarea răspunsului imun față de un Ag tumoral, care nu mai este prezentat din cauza micromediului tumoral (radicali liberi, prostaglandine)

PRODUCȚIA DE CITOKINE IMUNOSUPRESOARE

     -inhibă prezentarea Ag şi diferenţierea Tc                                   

INHIBAREA EXPRESIEI MOLECULELOR CMH

     -împiedică recunoașterea celulelor tumorale de către celulele T

PIERDEREA SAU REDUCEREA TAA

INHIBAREA APOPTOZEI

   -rezistența la apoptoză prin supraexpresia genelor antiapoptotice (Bcl-2)

CELULE Ts (reglatoare)

   - inhibă răspunsul imun, crescute în cancer

 ABSENŢA CO-STIMULĂRII

   -sistemul imun nu este alertat de prezența Ag, ci necesită un al doilea sistem de stimulare (numit co-stimulare) prin intermediul moleculelor exprimate de către APC.

Imunoterapia în cancer

-3 direcţii: stimulare nespecifică a reacţiilor imune, imunizare activă (vaccinuri) şi transfer pasiv al celulelor activate antitumoral =Terapie adoptivă

1 .Terapia non-antigen specifică. Imunocitokinele şi imunomodulatorii

Citokine = proteine reglatoare solubile, produse de celulele normale, care afectează creşterea şi metabolismul propriu, al celulelor vecine și al celulelor aflate la distanță (inclusiv cele tumorale). Ele interacționează cu receptorii de suprafață ai celulelor imune. Sunt peste 50, dar doar 2 sunt folosite în clinică , şi anume IL-2 şi IFN α.

IL-2 este produsă de limfocitele T active, și determină proliferarea altor subpopulații de celule imune, crește secreția de Ig și alte citokine (IL-1, IL-6, TNF α, IFN α). Este cea mai studiată citokină și este folosită cu succes în doze mari pentru tratarea cancerului renal și melenomului malign, în special în metastaze.      

IFN α,β, si γ sunt glicoproteine, descrise inițial în 1957 de Isaacs şi Lindenmann, produse de celule în urma infecției cu virusuri. Ele cresc expresia moleculelor CMH şi TAA, induc apoptoza și activează monocite, macrofage și fragmentul Fc al anticorpilor. IFN α este indicat în tratamentul leucemiei cu ,,celule păroase”.

2.Terapia cancerului prin mijloace de imunizare activă. Vaccinurile anti-tumorale

 Primele vaccinuri au fost testate pe animale și inițial s-au folosit extracte tumorale mixate cu agenți adjuvanți. S-a observat că TAA au dat răspunsuri imune. Vaccinurile derivate din virusuri inactivate sau preparatele antigenice sunt profilactice (previne debutul bolii), având ca scop un răspuns dirijat împotriva TSA, și o memorie de lungă durată, însă în prezent rezultatele sunt dezamăgitoare la pacienții cu cancer deja instalat. Primele vaccinuri testate au fost EBV, HVB, HTLV-1.

3.Tratamentele imune pasive. Transferul de celule adoptive

 Este o modalitate terapeutică în care celulele cu reactivitate antitumorală (celule efectoare activate) sunt administrate la un organism purtător de tumoră şi mediază direct sau indirect regresia tumorii respective. Limfocitele infiltrative tumoral (TIL) = limfocite T introduse direct în tumoră după cultură ,,ex vivo” în prezența IL-2, care manifestă o rată crescută de reactivitate anti-tumorală, în special în melanomul malign și metastaze pulmonare. Această metodă are ca scop prelungirea vieții, diferă de la un pacient la altul, și s-a observat o incidență redusă a regresiilor pe termen lung la puțini pacienți. Ea este o metodă investițională, nefolosită în clinică, datorită costurilor ridicate și necesității obligatorii de celule tumorale proaspete. Se mai administrează și celule efectoare activate și modificate prin terapie genică să exprime Ag, citokine și molecule co-stimulatoare.

          Pacientului i se recoltează leucocite prin leucafereză (aparat special de prelucrare a sângelui), care sunt prelucrate de o centrifugă specială. Limfocitele T sunt ataşate de bile magnetice învelite cu Ac monoclonali specifici pentru TCR, şi în prezenţa unui vector viral, şi apoi sunt lăsate câteva zile în bioreactor în diferite condiţii. Cultura este spalată şi verificată, după care celulele efectoare activate şi modificate sunt introduse în corpul pacientului, cu scopul de a-l trata.

IMUNOTERAPIE PASIVĂ-ANTICORPI MONOCLONALI

 

Anticorpii au rol de a se lega de o ţintă, adică de Ag, marcând-o pentru a fi distrusă de sistemul imun. Celulele tumorale pot exprima antigene specifice (TSA) care sunt diferite sau într-o densitate mai mare faţă de celulele normale. Aceste antigene pot fi utilizate pentru a produce anticorpi monoclonali specifici (AcMo), făcându-le ţinte posibile pentru imunoterapie. Anticorpii monoclonali sunt produşi în laborator ( sunt sintetici), ei ataşându-se de Ag tumorale.

• TSA sunt folosiţi ca anticorpi monoclonali, cu acţiune citolitică, un exemplu în acest caz ar fi impotriva Ag T4 limfolitic în tratamentul melanomului, cancerului ovarian şi de prostată.
• Ac monoclonali pot fi și vectori pentru radioizotopi, toxine sau citostatice, și au rol în studiul Ag tumorale și caracterizarea fenotipică a tumorilor. Ei prezintă de obicei toxicitate mică, şi de aceea sunt folosiţi în toate tipurile de cancer. Prima generaţie produsă a fost pe celule murine, rezultând o proteină cu efecte imunogenice limitate şi capacitate redusă de a recruta mecanismele imune efectorii. Aceste neajunsuri au fost depăşite prin himerizarea şi umanizarea AcMo. Ei prezintă activitate citotoxică anticorpo-dependentă (ADCC) şi de complement (CDC), alterarează semnale de transducţie ( transmitere) în celulele tumorale şi elimină antigenele critice de pe suprafața celulară. AcMo prezintă actual un loc în tratamentul cancerului. Sunt 8 tipuri folosite ca tratament, dar din păcate limitate de costuri ridicate şi reacţii secundare uşoare sau grave. Ei se clasifică în neconjugaţi (inhibă interacţiunea receptor-ligand), conjugaţi=toxine himerice (cu specificitate citotoxică pe ţinte, se leagă de o toxină sau radioizotop) şi radioimunoconjugaţi.

Pot fi direcţionaţi spre o varietate de ținte:

• Proteinele celulare de suprafaţă (atât din tumorile solide cât şi din celulele maligne circulante)
• Ag asociate stromei tumorale
• Ag asociate vascularizaţiei tumorale (VEGF)
• liganzii care susţin creşterea tumorală (EGF-R)

Astăzi sunt utilizate şi proceduri transgenice pentru a produce anticorpi umanizaţi sau umani recombinaţi compleţi. Anticorpii sunt desemnaţi generic cu sufixul „ mab”. Anticorpii de provenienţă murină sunt desemnaţi prin sufixul „momab”, cei himerici murini-umani prin „ximab”, cei umanizaţi prin „ zumab” iar cei umani prin „ mumab”.

Anticorpii monoclonali neconjugaţi

Afectează direct căile de semnal prin inhibarea interacţiunilor ligant-receptor. Sunt anticorpi monoclonali împotriva fie receptorilor sau a liganzilor acestora. Aceştia pot stimula indirect mecanismele de apărare ale gazdei, precum citotoxicitatea celulară mediată de anticorpi (ADCC) sau liza mediată de complement, determinând activitatea antitumorală. Exemple: rituximab( anti CD-20, tratamentul limfoamelor maligne non-Hodgkin cu celule B de joasă malignitate ), trastuzumab, alemtuzumab (anti CD-52, tratamentul leucemiei limfatice cu celule B tratată iniţial cu agenţi alkilanţi, la care terapia cu Fludarabină a eşuat, leucemia prolimfocitică cu celule T) cetuximab, panitumumab, bevacizumab, ofatumumab (anti CD-20), epratuzumab (anti CD-22) etc. Obstacolele majore în cale terapiei cu anticorpii monoclonali rămân:

- antigenicitatea heterogenă tumorală;

- fracţia redusă de AcMo injectaţi care se leagă de tumoră;

- incapacitatea anticorpilor de a penetra masele tumorale solide voluminoase;

- legarea AcMo de antigene precirculante (legarea încrucişată a Ac monoclonali).

  

Anticorpii monoclonali conjugaţi -imunoconjugatele (toxinele himerice)

Agenţii conjugaţi constă în legarea unui anticorp sau o proteină legată de o toxină sau radioizotop.

  Gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg) =anti CD-33, conjugat cu un antibiotic antitumoral, calicheamicin. Legarea de antigenul CD-33 de pe celulele mieloide determină internalizarea complexului antigen-anticorp. Calicheamicin este eliberat în celule unde determină rupuri ADN şi moartea celulei. Este utilizat în leucemia mieloidă acută ( LAM) recidivată. Denileukin difitox (Ontak) = prezinta proteina de fuziune „IL-2/toxină difterică”, foarte activă în neoplaziile ale căror celule exprimă receptorul IL-2, în limfoamele maligne T cutanate, unde induce apoptoza. Ingineria genetică a făcut posibilă obţinerea de gene „de fuziune” ce asociază porţiunea citotoxică a genelor bacteriene (ex. toxina difterică sau exotoxina speciilor de Pseudomonas) şi liganzi-ţintă (ex. citokine: IL-2, TGF-α). Aceste gene pot fi utilizate pentru a produce proteine himerice care se localizează specific la nivelul celulelor, care exprimă receptori. Imunoconjugatele au fost de asemenea construite cu toxine biologice sau antibiotice antitumorale.

Anticorpii radioimunoconjugaţi

Ibritumomab tiuxetan ( Zevalin) = anticorp murin, marcat cu yritrium radioactiv, utilizat la pacienţii cu limfom maligmn non-hodgkinian folicular CD20+, care sunt rezistente la terapia cu riruximab.Ibritumomab se leagă prin legături covalente de tiuxetan, un agent chelator. Agentul chelator se leagă strâns de radioizotop.Ibritumomab se leagă de Ag, permiţând emisia de radiaţii împotriva celulelor înconjurătoare. Agentul determină citotoxicitatea dependentă de anticorpi mediată prin complement şi induce apoptoza.

Tositumomab ( Bexxar), I-tositumomab ( Bexxar) = un anticorp murin legat covalent cu iod radioactiv. Are ca ţintă antigenul CD-20, care se găseşte pe suprafaţa limfocitelor B , determinând o iradiere ţintită, moartea celulelor tumorale antigen-negative. Moartea celulelor apare prin apoptoză, prin ADCC, mediată de anticorpi şi prin radiaţia emisă de radioizotopi.